Реакция пристеночной микробиоты толстой кишки на использование препарата Альфа-Нормикс в лечебном процессе

Скачать оригинал

Осипов Г. А.,
доктор биологических наук
Академическая группа Академика Ю.Ф.Исакова при НЦ ССХ им А.Н.Бакулева
Санкт-Петербург

 

Отчет об исследовании методом масс-спектрометрии микробных маркеров

Действующее вещество — Рифаксимин — антибиотик широкого спектра действия из группы рифамицина. Как и другие представители этой группы, необратимо связывает бета-субъединицы фермента бактерий ДНК-зависимой РНК-полимеразы и, следовательно, ингибирует синтез РНК и белков бактерий.

СОДЕРЖАНИЕ
  • Методика анализа
  • Результаты
Методика анализа

Для анализа биоптат толстой кишки в количестве 1-4 мг помещали в виал, емкостью 1,5 мл, с завинчивающейся крышкой с тефлонированной прокладкой, заливали 400 мкл 1М соляной кислоты в метаноле, завинчивали плотно крышкой и подвергали кислому метанолизу при  80ºС в течение 1 часа. К охлажденной реакционной среде добавляли 300 нг стандарта (дейтерометиловый эфир тридекановой кислоты), растворенного в гексане. Затем проводили экстракцию двумя порциями по 200 мкл гексана, встряхнув смесь на вортексе и позволяя ей отстоятся в течение 5 мин при комнатной температуре. Объединенный экстракт переносили в чистый виал, высушивали 7 мин при  80°С и сухой остаток обрабатывают 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида, в течение 9 мин при 80°С при  закрытой крышке. Для проведения анализа смесь эфиров в количестве 2 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы AT-5973 Аджилент Технолоджис (Agilent Technologies Inc.) (США). Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Аджилент технолоджис длиной 25м и внутренним диаметром 0,25мм, газ-носитель — гелий. Режим анализа — программированный, скорость нагрева термостата колонки 7 ºС/мин в диапазоне 135 — 320ºС. Выдержка при начальной температуре 1,5 мин. Температура испарителя – 280ºС, интерфейса – 270ºС. Масс-спектрометр — квадрупольный, с ионизацией электронами (70 эв) в режиме селективных ионов, или масс-фрагментографии (МФ), при периодическом сканировании до тридцати ионов в пяти интервалах времени.

Результаты

Суммарная колонизация кишечной стенки микроорганизмами у половины пациентов и в среднем как до, так и после лечения с применением Альфа-Нормикс оказалась более чем вдвое выше нормы, но персонально менялась хаотично. У Боруновой, Черницкой, Кучеренко после курса лечения уменьшилась до нормы, у Федченко и Дубковой сохранился трех – пяти-кратный дефицит колонизации, а у Панова и Хомякова общая численность микроорганизмов выросла с перекомпенсацией в четыре и два раза соответственно (рис. 1, 5).

Рис. 1. Суммарная численность микроорганизмов пристеночного слоя толстой кишки до (индекс пациента 1) и после (индекс пациента 2) лечения с применением Альфа-Нормикс. Показаны также норма здоровых доноров, норма по маркерам в крови и средние значеия численности до и после лечения.

Численность лактобацилл в среднем не изменилась после курса Альфа Нормикс, при том что у одних пациентов она возрастала, у других уменьшалась, у третьих оставалась на прежнем уровне (рис. 2, 5).

Рис. 2. Численность лактобацилл пристеночного слоя толстой кишки до (индекс пациента 1) и после (индекс пациента 2) лечения с применением Альфа-Нормикс. Показаны также норма здоровых доноров, норма по маркерам в крови и средние значеия численности до и после лечения.

То же относится к эубактериям (род Eubacterium) – средний уровень не изменился, но у Боруновой и Щегляевой их численность уменьшилась, а у Хомякова и Бондарева – возросла (рис. 3, 5) .

Рис. 3. Численность эубактерий пристеночного слоя толстой кишки до (индекс пациента 1) и после (индекс пациента 2) лечения с применением Альфа-Нормикс. Показаны также норма здоровых доноров, норма по маркерам в крови и средние значеия численности до и после лечения.

Бифидобактерии выросли у Хомякова и Вуж, а у Панова и Кучеренко – уменьшились, оставаясь в среднем на одном уровне в целом по группам (рис. 4, 5).

Рис. 4. Численность бифидобактерий пристеночного слоя толстой кишки до (индекс пациента 1) и после (индекс пациента 2) лечения с применением Альфа-Нормикс. Показаны также норма здоровых доноров, норма по маркерам в крови и средние значеия численности до и после лечения.

Не претерпели в среднем изменений и пропионобактерии (группа P. Freudenreichii) и другие нормальные обитатели толстой кишки – клостридии группы Clostridium ramosum часть актинобактерий (Rhodococcus, Actinomyces, Nocardia) дрожжи Candida и другие микроорганизмы (рис. 5).

Рис. 5. Среднее значение численности микроорганизмов пристеночного слоя толстой кишки до и после лечения с использованием Альфа-нормикс. Рыжим цветом выделены значения, превышающие норму более чем в два раза. Бирюзовым – уменьшение численности после лечения, малиновым – увеличение.

Суммарный лечебный эффект проявился в среднем в уменьшении численности пневмококка, анаэробного пептострептококка, бактероидов (Prevotella, Bacteroides fragilis), селеномонад, вируса герпеса и части актинобактерий (рис. 5).

У некоторых пациентов – Елесева, Мухина, Бондарев и других существенно увеличилась численность Clostridium perfringens (рис. 6), что в целом дало рост инфекции после лечения. В общем по группе возросла более чем на порядок концентрация маркеров представителей семейства Enterobacteriaceae (E.coli и другие) но тоже в основном из-за девятерых пациентов: Чернецкая, Самочкин, Новикова, Гасанов и другие. Примерно у половины пациентов увеличилась численность бактерий группы Fusobacterium/Haemophylus.

Рис. 6. Численность Clostridium perfringens пристеночного слоя толстой кишки до (индекс пациента 1) и после (индекс пациента 2) лечения с применением Альфа-Нормикс. Показаны также норма здоровых доноров, норма по маркерам в крови и средние значеия численности до и после лечения.

Подробные данные анализа по отдельным пациентам и групповому сопоставлению данных по микробам приведены в прилагаемых файлах Excel в архивированном приложении.

Web-site: www.rusmedserv.com/microbdiag/

Комментировать