Определение состава донных микробных сообществ водных экосистем по жирно-кислотным маркерам

УДК 579.68:574.5:543.51

определение  состава ДОННЫХ микробных сообществ водных экосистем по жирно-кислотным маркерам

© 2014 г. Н.Г. Шерышева *,**, Г.А. Осипов **,  В.В.  Халько***

*Институт экологии Волжского бассейна РАН,

445003 Тольятти, Самарская обл., ул. Комзина, 10

е-mail: sapfir-sherry@yandex.ru

**Академическая группа Академика РАМН Ю.Ф. Исакова при НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева

121552  Москва, Рублевское шоссе, 135

***Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН,

152742  пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н

 

Рассмотрена возможность применения молекулярного метода газовой хроматографии-спектрометрии (ГХ-МС) в экологических исследованиях структуры и функционирования микробных сообществ донных отложений водных экосистем.  Наличие специфических веществ (маркеров) в клеточных компонентах микроорганизмов дает возможность количественного определения состава микробного сообщества.  Составлен локальный банк микробных маркеров для озерных илов.

Ключевые слова: донное микробное сообщество,  таксономический состав, жирно-кислотные маркеры, озерные илы.

 

введение

Донный микробиоценоз – один из важнейших структурно-функциональных элементов водных экосистем. Методы оценки его таксономического и количественного состава до сих пор остаются наименее изученными и актуальными [9]. Одним из перспективных в этом отношении и интенсивно разрабатываемом в последние годы является метод газовой хромато-масс-спектрометрии  (ГХ – МС) [10, 3], позволяющий по составу жирных кислот, альдегидов и гидроксикислот клеточной стенки микроорганизмов оценить их таксономическую принадлежность [4. 31, 35].

В настоящее время метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) широко применяется в исследованиях таксономического разнообразия различных микробных сообществ. Бактерии отличаются по составу жирных кислот и альдегидов от растений и животных а также фонового органического вещества среды обитания. Показана родо- и видоспецифичность состава жирных кислот, а также его межлабораторная воспроизводимость. [31]. Опубликованы результаты исследований по идентификации и характеристике экологически значимых прокариот в модельных системах, осадках пресноводных озер, морских экосистем, микробных матах [19, 25, 28, 30, 34, 36].

Рассматриваемый метод (МСММ) основан на высокоточном определении специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов микроорганизмов. Наличие специфических веществ из числа клеточных компонентов и метаболитов микроорганизмов дает возможность не только для качественной, но и для количественной оценки структуры микробиальных сообществ [3, 12]. Существенным преимуществом газовой хроматографии (ГХ) и ГХ-МС при идентификации таксономического состава микробиоценозов заключается в том, что они не требуют изоляции жизнеспособных клеток из образца и их культивирования на селективных средах. Видовой состав микробного сообщества определяется путем анализа липидной фракции общей биомассы.

Методом МСММ был определен количественный и качественный состав сообщества микроорганизмов нефтяного пласта [11]. Позже были проведены исследования бактериального сообщества речного ила [13], иловых микробоценозов магнитных модельных систем, поставленных на природном материале некоторых водоемов Астраханской области [14]. В последнее время метод ГХ-МС успешно применяют для определения состава сообществ почвенных ценозов [2], компоста [33], структуры микробных сообществ морских донных осадков в загрязненных нефтепродуктами двух бухт Японского моря [36]. Идентифицированы различные группы микроорганизмов глубоководных губок и донных осадков озера Байкал [1]. Ранее нами [15-17] были исследованы накопительные культуры железовосстанавливающих бактерий и экспериментально выявлены ведущие эколого-трофические группы бактерий, осуществляющих анаэробное Fe(III) восстановление при окислении глюкозы, водорода и метана.

В настоящей работе предпринята попытка применения метода масс-спектрометрии липидных маркеров для определения таксонов сообществ микроорганизмов в донных (иловых) отложениях  пресноводных экосистем.

 

материал и методы исследований

Пробы илов были отобраны из разнотипных водоемов Самарской области и Волжско-Камского государственного природного биосферного заповедника. Исследованы серные, карстовые озера, меромиктические водоемы с высоким содержанием железа, гумуса, сульфатов, органического вещества  в илах [7].

Для изучения таксономической структуры микробного донного сообщества применен метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) с реконструкцией состава микроорганизмов (МСММ) [10, 3], позволяющий определить родовую (а иногда и видовую) принадлежность бактерий численностью более 104 кл/г сухого ила. Анализ проводили на хромато-масс-спектрометре АТ 6850/5973 фирмы Agilent Technologies в лаборатории Академической группы Академика РАМН Ю.Ф. Исакова. Масс-спектрометр квадрупольный с диапазоном масс 2 — 550 аем имеет разрешающую  способность  0,5 аем  во  всем  рабочем диапазоне. Ионизация электронами  70эв. Чувствительность прибора составляет 0,01нг по метилстеарату. Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленого кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм. Неподвижная фаза НР-5ms Хьюлетт-Паккард с толщиной слоя 0,25 мкм. Хроматографирование проводили в режиме  программирования температуры от 120 до 320°C со скоростью 7 град/мин. Температура инжектора и интерфейса 280°C. Обработку данных проводили с помощью штатных программ прибора. Вещества в хроматографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных программ с базами данных масс-спектров NIST. Состав микробных сообществ рассчитывали в электронных таблицах «EXCEL» с помощью разработанного алгоритма расчета [12].

Для микробиологического подтверждения экспресс-метода МСММ идентификации состава микроценоза нами были проведены посевы для целевого выделения изолятов органотрофных микроорганизмов из сообществ разнотипных озерных илов. Идентификация выделенных микроорганизмов по составу клеточных жирных кислот проводили на бактериальном анализаторе Шерлок (Microbial identification system, MIDI Inc., Delaware, USA) [31]. Клетки с агара в количестве 40-60 мг подвергали кислому метанолизу в 1 М HCl в метаноле в 0,4 мл реактива в течение одного часа при 80°С. В результате метанолиза жирные кислоты освобождались из липидов клеточной мембраны и липополисахаридов клеточной стенки  в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, и раствор упаривали до 60 мкл. Определение вида микроорганизмов осуществлялось автоматически по программе прибора при сопоставлении полученного профиля жирных кислот с базой данных, включающей около 2000 штаммов микроорганизмов. Всего за период исследований выполнено 22 анализа накопительных и чистых культур железовосстанавливающих микроорганизмов с последующей идентификацией таксономической принадлежности.

 

Результаты и их обсуждение

Состав жирных кислот и альдегидов суммарной биомассы илового микробного сообщества.

Анализ  жирнокислотного состава разнотипных илов озер выявил наличие  ряд веществ, характерных микроорганизмов.  Они приведены в табл. 1 с отнесением к таксонам микроорганизмов, у которых эти вещества присутствуют в составе клеточных липидов. Основными компонентами  метанолизата липидной фракции исследованных образцов оказались насыщенные и ненасыщенные  прямоцепочечные и разветвленные жирные кислоты.  Обнаружение в пробе жирных кислот с числом атомов углерода от 12 до 19 считается признаком бактериальной биомассы [8, 25].

Некоторые специфические вещества (маркеры) оказались характерными для крупных таксономических групп микроорганизмов. Так, метанотрофные бактерии определялись по 8-гексадеценовой (16:1ω8) кислоте [5], представители семейства Enterobacteriaceae — по циклопропан-гептадекановой (17cyc) кислоте [4; 29]. Особо следует отметить наличие в биомассе 2- и 3-гидроксикислот, свидетельствующих о присутствии в сообществе грамотрицательных бактерий.

Анализ липидных компонентов пробы показывает, что некоторые из них могут быть отнесены  к  вполне определенным родам или даже видам  микроорганизмов.  Так, наличие гидроксикислот с 12-ю атомами углерода (2,3 — гидрокси-додекановая) указывает на присутствие представителей р. Pseudomonas [4, 27]. Для биомассы цианобактерий характерны 3-гидроксигексадекановая (3h16), 3-гидроксиоктадекановая (3h18) и 3-гидрокси-гексадекановая (3h16) кислоты. Дополнительным признаком у цианобактерий рр. Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis Oscillatoria выделены жирные кислоты антеизо-изомиристиновая (а14); антеизо-гексадекановая (а16), а также alfa 18:3 и gamma18:3 октадеценовые. Наличие развлетвленных  гидроксикислот с 15-ю атомами углерода позволяет предполагать наличие рр. Azospirillum (собственные данные), Cytophaga [21]. Оксиизотридекановая (hi13) кислота известна для организмов р. Xanthomonas. 10-гидроксистеариновая (10h18) кислота обнаружена в метаболитах Clostridium perfringens и некоторых других бактерий (в том числе нокардий).

 

Таблица 1. Состав липидных компонентов биомассы микроорганизмов озерных илов

Обозначение Название липидного

компонента

Моли, % Характерные микроорганизмы
Жирные кислоты
1 10:0 декановая Rhodococcus terrae
2 12:0 додекановая 0,20 р. Flexibacter 
12:1 додеценовая р. Rhodobacter
3 i13 изо-тридекановая 0,07 р. Xanthomonas, Bacillus subtilis
4 а13 антеизо-тридекановая 0,05 Bacillus cereus, р. Cellulomonas
5 13:0 тридекановая 0,11 нет прямого отнесения к микроорганизму
6 i14 изо-миристиновая 0,26 pp. Streptomyces, Bacillus, Spirochaeta
7 a14 антеизо-изомиристиновая   рр. Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis
8 14:1 ω7 9-тетрадеценовая 0,06 pp. Sphaerotilus, Clostridium
9 14:1 ω5 11-тетрадеценовая 0,04 Acetobacterium, железоредуктор KM-2 (Лебедева)
10 14:0 тетрадекановая 29,89 большинство видов микроорганизмов
11 10Me14 10-метилтетрадекановая 0,41 актинобактерии
12 i15 изо-пентадекановая 2,77 многие  виды   микроорганизмов;

Arthrobacter

13 а15 антеизо-пентадекановая 2,09 многие  виды  микроорганизмов;

рр. Azotobacter, Micrococcus

14 15:1 пентадеценовая 0,17 Cl. putrefaciens, Cl. sporogenes, Cl. propionicum; Gеodacter humireducens
15 15:0 пентадекановая 1,16 р Cytophaga,  Pseudomonas stutzeri 
16 i16:1 изогексадеценовая 0,32 р. Pseudonocardia
17 i16 изогексадекановая 0,57 Streptomyces rimosus,  Bacillus coagulans
18 a16 антеизо-гексадекановая   р. Anabaena
19 16:1 ω9 7-гексадеценовая 0,65 р. Methylococcus
20 16:1 ω8 8-гексадеценовая р. Methylomonas, Methylomicrobium
21 16:1 ω7с цис-9-гексадеценовая 4,78 большинство видов микроорганизмов, Aquaspirillum, Thiotrix, Macromonas, Leucothrix
22 16:1 ω7t транс-9-гексадеценовая 0,97 Nocardia carnea
23 16:1ω5 11-гексадеценовая 0,61 железоредукторы
24 10Ме16 10-метилгексадекановая 0,13 р. Desulfobacter,  Rhodococcus  equi
25 i17:1 изопентадеценовая 0,29 р. Desulfovibrio, Heliobacterium
26 i17 изо-гептадекановая 0,61 рр. Bacillus, Propionibacterium
27 17:1 пентадеценовая 0,11 рр. Mycobacterium (быстрорастущие), Clostridium, Aquaspirillum
28 17cyc циклопропан-гептадекановая 0,25 семейство Enterobacteriaceae
29 a17 антеизо-гептадекановая 0,66 рр. Corynebacterium aquaticum,  Nocardia, Micromonospora
30 17:0 гептадекановая 0,67 большинство видов микроорганизмов,

минорный компонент

10Me17 10-метилгептадекановая Actinomadura roseola
31 i18 изо-октадекановая 0,03 р. Sulfobacillus, Clostridium difficile
32 18:2 октадекадиеновая 1,38 грибы, дрожжи, простейшие
33 alfa18:3 альфа-октадеценовая   рр. Oscillatoria, Anabaena, Aphanizomenon
34 gamma18:3 гамма-октадеценовая   р. Microcystis
35 18:1ω9 9-октадеценовая 23,09 все микроорганизмы
36 18:1ω7c цис-11-октадеценовая 5,87 рр. Pseudomonas, Caulobacter, Nitrobacter, Beggiatoa
38 18:0 октадекановая 11,46 большинство микроорганизмов
39 i19 изононадекановая 0,12 Bacillus subtilis
40 а19 антеизононадекановая 0,08 р. Caulobacter 
41 19cyc циклононадекановая 0,13 Agrobacterium radiobacter,

р. Ectothiorhodospira

42 19:0 нонадекановая 0,23 pp. Nitrobacter, Bacillus, Burkholderia cepacia
43 20:1ω9 9-эйкозеновая 0,09 рр. Actinomyces, Thiobacillus
44 20:1ω11 11-эйкозеновая 0,05 Propionibacterium, Actinomyces
Гидроксикислоты
45 3h10 3-гидроксиоксидекановая 0,05 Pseudomonas putida, р. Hydrogenophaga
46 3h11 3-гидроксиундекановая 0,01 железоредуктор FeRed (Турова,1996)
47 3h12 3-гидроксидодекановая 0,19 рр., Pseudomonas, Beggiatoa
48 2h12 2-гидроксидодекановая 0,04 рр. Pseudomonas
49 3hi13 3-гидроксиизтридекановая 0,34 р. Xanthomonas
50 3hа13 3-гидрокси-антеизо-тридекановая 0,04 нет прямого отнесения к микроорганизму
51 3h13 3- гидрокситридекановая 0,03 Bacteroides hypermegas
52 3hi14 3-гидрокси-изотетрадекановая 0,10 нет прямого отнесения к микроорганизму
53 3h14 3-гидрокситетрадекановая 1,04 рр. Aeromonas, Burkholderia
54 3hi15 3-гидрокси-изопентадекановая 0,64 рр. Flavobacterium,  Cytophaga, Flexibacter
55 3ha15 3-гидроксиантеизопентадекановая 0,26 рр. Cytophaga, Flexibacter
56 2hi15 2-гидрокси-изо-пентадекановая 0,14 рр. Azospirillum, Flexibacter
57 3h15 3-гидроксипентадекановая 0,07 штаммы ZOR-1/ZOR-2
58 2h15 2-гидроксипентадекановая 0,05 р. Sphingomonas
59 3h16 3-гидроксигексадекановая 0,97 рр. Cytophaga, Flexibacter; класс Cyanobacteria +
60 3hi17 3-гидрокси-изо-гептадекановая 0,50 рр. Flexibacter, Cytophaga
61 3h17 3-гидроксигептадекановая 0,11 р. Bacteroides
62 3h18 3-гидроксиоктадекановая 0,38 рр Acetobacter, Macromonas;

класс Cyanobacteria

63 10h18 10-гидроксиоктадекановая 0,08 рр. Clostridium, Nocardia
3hi20 3-гидроксиизо-эйкозановая р. Chlamydia
Жирные альдегиды
64 14а тетрадекановый 0,13 рр. Spirochaeta, Clostridium
65 a15a антеизо-пентадекановый 0,12 рр. Butyrivibrio, Eubacterium
66 i15а изо-пентадекановый 0,19 рр. Butyrivibrio, Propionibacterium
67 i16а изо-гексадекановый 0,05 р. Eubacterium
68 16a гексадекановый 0,80 рр. Clostridium, Acetobacterium
69 a17a антеизо-гептадекановый 0,04 Propionibacterium freudenreichii
70 i17a изо-гептадекановый 0,33 рр. Propionibacterium, Clostridium
71 17a гептадекановый 0,07 р. Propionibacterium
72 15a пентадекановый 0,34 р. Butyrivibrio
73 18а октадекановый 0,11 царство Protozoa
74 18:1а октадеценовый   р. Desulfotomaculum

Обозначения веществ: 17:1 — 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия — число двойных связей; h — оксикислота; а,i — в начале означает разветвление; аlc — в конце символов — спирт, cyc — циклопропановая кислота. Например, 3ha17 — 3-гидрокси-антеизо-гептадекановая кислота

 

Из других  характерных  жирных  кислот  следует  отметить 10-метилгексадекановую (10Me16),  специфичный маркер Rhodococcus equi [20, 26]. Для другой группы родококков с типовым видом R. terrae характерна декановая кислота. В составе биомассы ила присутствует уникальная изо-гептадеценовая кислота (i17:1), известная у р.  Heliobacterium и сульфатредукторов р. Desulfovibrio. 10-метил-гексадекановая  кислота (10Ме16) — альтернативно может быть маркером р. Desulfobacter [32]. Традиционными микробиологическими методами было подтверждено наличие жизнеспособных бактерий Desulfovibrio vulgaris и Desulfobacter sp. [11]. Разветвленные кислоты (изомиристиновая —  i14,  изогексадекановая — i16, изонанодекановая — i19) с учетом их соотношения следует отнести к бактериям рр. Streptomyces, Bacillus [23, 24, 26]. Из других редких жирных кислот можно отметить эйкозеновую (20:1ω9), которая присутствует в клетках актиномицет [18] и тиобацилл (собственные данные). Остальные наиболее вероятные отнесения найденных жирных кислот к микроорганизмам их содержащим приведены в табл. 1.

Маркеры  Beggiatoa, Thiobacillus, Spirochaeta, Sphaerotilus получены в результате совместных исследований с проф. Дубининой Г.А. ИНМИ РАН. Среди сем. Cyanobacteria выявлены представители родов Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis.

Анализ жирно-кислотного состава железовосстанавливающих бактерий. Чтобы оценить количество бактерий, восстанавливающих железо, мы исследовали состав семи видов чистых культур (FeRB Lovley) из коллекции профессора D. Lоvley University of Massachusetts, США: Shewanella alga, Desulfuromonas palmitatis,  Geobacter humireducens, G. sulfurreducens, G. Metallireducens, Geothrix fermentas, Geovibrio ferrireducens. Обнаружилось, что все они содержат примерно от 2 до 5% 11-гексадеценовой кислоты (16:1ω5), которая может служить их общим маркером. Эта кислота найдена нами в составе жирных кислот озерных илов и может служить мерой содержания железоредукторов в сообществе микроорганизмов ила.

Другой диссимиляционный железоредуктор — штамм FeRed [12] определяется по специфичному компоненту — окситридекаденовой кислоте (3h13) и оксиундекановой (h11). Штамм FeRed KM-2, выделенный из речного ила (Н. Лебедева, частная коллекция) определяется по содержанию 11-тетрадеценовой  кислоты 14:1 ω5. Присутствие представителей железобактерий в структуре сообщества илов не противоречит проведенным ранее исследованиям группы бактерий цикла железа [6].

Наряду с жирными кислотами и оксикислотами большую группу маркерных веществ, существенно повышающих специфичность хемодифференциации микроорганизмов, дают альдегиды. Так, антеизопентадекановый (а15а) и изопентадекановый (i15a) альдегиды указывают на присутствие р. Butyrivibrio. Для  представителей р. Desulfotomaculum характерен октадеценовый альдегид (18:1а). Помимо бактериального и актиномицетного комплекса присутствует маркеры (альдегиды и стеролы), свидетельствующие о наличии представителей простейших, грибов, дрожжей и водорослей.

Анализ изолятов органотрофных микроорганизмов, выращенных на питательных средах. Для микробиологического подтверждения экспресс-метода микробных маркеров идентификации родового/видового состава микробных сообществ нами были проведены посевы изолятов сапрофитных, лактатокисляющих и ацетатокисляющих бактерий на агаризованных питательных средах. Чистые культуры бактерий были выделены из илов озер разного типа, расположенных на территории Самарской Луки – излучины р. Волга в ее среднем течении. Результаты  анализа представлены в табл. 2. Полученные жирнокислотные профили изолятов были включены в базу данных микробных маркеров.

 

Таблица 2. Видовое отнесение штаммов микроорганизмов по профилям жирных кислот

Озеро Тип ила Штамм Идентификация Шерлок + ГХ-МС подтверждение веществ Субстрат
Лизинка Торфянистый ShCh-3 Burkholderia

(Pseudomonas cepacia)

Лактат
М. Карстовое Пелитовый ShCh-4 Salmonella (возможно, E.coli) РПБ*
Серебрянка Алевритовый ShCh-5 Streptomyces rimosus Ацетат
Серебрянка Алевритовый ShCh-6 Ассоциация: S. rimosus, Pseudomonas sp, Enterobacteriaceae sp. Ацетат
Клюквенное Торфянистый ShCh-7 Bacillus РПБ
Золотенка Илистый песок ShCh-8 Streptomyces rimosus Ацетат
Б. Шелехмет-ское Черный ил ShCh-9 Bacillus РПБ
Ужиное Песчанистый ShCh-10 Bacillus Глюкоза
Ужиное Песчанистый

 

ShCh-11 Ассоциация: Bacillus, Enterobacteriaceae sp. РПБ
Золотенка Илистый песок ShCh-12 Bacillus coagulans РПБ
Харовое Детритный ил ShCh-14 Corinebacterium aquaticum РПБ

Примечание: РПБ* – рыбопептонный бульон

Приведенный в табл. 1 перечень микроорганизмов является руководящей основой при выявлении возможных видов, соответствующих тому или иному маркеру. Определение реального состава  пробы озерного ила осуществляется путем разложения суммарного профиля жирных кисло на составляющие его рода и виды микроорганизмов по технологии реконструкции микробного сообщества (МСММ). Примером такой реконструкции  является вычисленный состав микробного сообщества, обитающего в прибрежном биотопе озера Серебрянка (рис. 1).

Рис. 1. Родовой (видовой) состав и численность бактериобентоса алевритового ила в озере Серебрянка (Самарская Лука)

 

Необходимость в специальном алгоритме рекострукции состава микробного сообщества вытекает из того обстоятельства, что большинство маркерных веществ (табл 1) характерно для более чем двух  таксонов микроорганизмов, поэтому нельзя прямо рассчитать численность каждого из них по одному маркеру. В микробном сообществе неизбежно наложение профилей жирных кислот составляющих его микроорганизмов, когда в определяемой концентрации вещества имеется вклад от двух или нескольких микробов. Суперпозицию можно разрешить путем составления для каждого обнаруженного вещества (жирной кислоты, альдегида) уравнения, которое количественно суммирует вклады всех микроорганизмов, имеющих это вещество. Рассмотрим суперпозицию из трех микроорганизмов FeRed KM-2 (Лебедева), Azospirillum и Bacillus subtilis с разными профилями жирных кислот (рис. 2) в сообществе ила оз. Серебрянка. По концентрации маркеров можно вычислить число клеток этих видов в сообществе по формуле:

Xj=Ai.S/Rij              (1)

Эта формула вытекает из очевидной линейной (пропорциональной) зависимости между числом клеток микроба Xj и площадью пика Ai, принадлежащего только одному ему вещества в хроматограмме. В этой формуле S — постоянный коэффициент пропорциональности, учитывающий условия анализа и чувствительность прибора, а Rij — доля i-того вещества, по которому ведется расчет в жирнокислотном профиле определяемого микроба.

Рис. 2. Расчет видового состава микробного сообщества на примере трех микроорганизмов с  разными профилями жирных кислот

 

В нашем примере получаем

численность  FeRed KM-2       X FeRed KM-2=A 14:1ω5.S/3,66   или X FeRed KM-2=A a15.S/2,54

численность    Azospirillum        X Azospirillum =A 2hi15.S/6,61

численность  Bacillus subtilis   X B. subtilis =A i13.S/8,10   или X B. subtilis =A i19 S/6,10

 

В случае перекрывания пиков, (т.е. когда одно и то же вещество есть у разных членов сообщества) решаем обратную задачу: определение площади ГХ-пика через концентрацию микроба и долю жирной кислоты (вещества) в его профиле.

В общем случае для m веществ суммарной биомассы сообщества, включающего в качестве членов n родов (видов) микроорганизмов, можно составить систему из m уравнений для n неизвестных. Получится матрица, в которой каждое неизвестное есть численность одного из таксонов микробного сообщества.

А1. q = X1R1,1 + X2R1,2 + X3 R1,3 +………+  XnR1,n

А2. q = X1R2,1 + X2R2,2 + X3R2,3 +………+  XnR2,n                                   (2)           

А3. q = X1R3,1 + X2R3,2 + X3R3,3 +………+  XnR3,n     

::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

Аm. q = X1Rm,1 + X2Rm,2 + X3Rm,3 +………+  XnRm,n

 

где А  — площадь суммарного хроматографического пика, q — коэффициент пропорциональности, X с индексами 1,2 и 3  количество (концентрация) организма или соответственно доля вещества в профилях ЖК  каждого из этих организмов, R — доля вещества, по которому ведется расчет, в жирнокислотном профиле определяемого микроба. Площади пиков мы определяем из хроматограммы, величины R — из банка данных по чистым культурам. Величина q определяется из условий пробоподготовки и чувствительности прибора. Система имеет практически приемлемое приближенное решение для локального микробного сообщества (донных отложений, почвы, компоста, активного ила и т.д.), которое сформировано в виде группы формул в таблицах EXCEL [3].

Выводы. На основании литературных и нами полученных данных при использовании метода ГХ-МС анализа озерных илов, выявлено около 100 соединений из класса жирных кислот, оксикислот и альдегидов, на основании которых составлен  локальный банк микробных маркеров для иловых отложений. Создание такого банка позволит значительно расширить изучение структурно-функциональной организации донного сообщества микроорганизмов водных экосистем. Мы полагаем, что жирнокислотное маркирование микроорганизмов в настоящее время является наиболее чувствительным и эффективным методом оценки структуры микробного сообществ в экологических исследованиях. Он позволяет провести количественную оценку таксономического состава микробиоценозов в донных отложениях, что делает его незаменимым при решении ряда важнейших задач, таких как: определение таксономического разнообразия донных микробных сообществ; изучение структуры доминантного комплекса; установление закономерностей пространственно-временного развития на основе выявления связей с абиотическими компонентами экосистемы; исследование трофических взаимодействий; выявление  ведущих групп микроорганизмов, осуществляющих важные процессы в донных отложениях; оценка гидробиологических индексов микробной популяции (например, индексы биологического разнообразия, доминирования, видового сходства и др.).

 

Список  литературы

  1. Базарсадуева С.В.Экологические особенности распределения липидов гидробионтов в глубоководной зоне озера Байкал // Автореф. дисс. … канд. биол. наук. Иркутск, 2013. 25 с.
  2. Верховцева Н.В., Ларина Г.Е., Спиридонов Ю.Я., Степанов А.Л., Осипов Г.А.Микробные консорциумы почв агроценозов разных природных зон России с учетом их сельскохозяйственного использования // Проблемы агрохимии и экологии. 2008. № 2. С. 37-43.
  3. Верховцева Н.В., Осипов Г.А. Метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии в изучении микробных сообществ почв агроценоза // Проблемы агрохимии и экологии. 2008. № 1.  С. 51-54.
  4. Вейант Р., Мосс У., Холлис Д., Джордан Дж., Кук Э., Дейншвар М.Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. М. Мир, 1999. С. 612-783.
  5. Гальченко В.Ф.Метанотрофные бактерии. М.:  ГЕОС, 2001. 500 с.
  6. Дубинина Г.А.Биология железобактерий и их геохимическая деятельность: Дис. … д-ра биол. наук. — М., 1977. — 448 с.
  7. Жариков В.В., Горбунов М.Ю., Быкова С.В., Уманская М.В., Шерышева Н.Г.Экология сообществ бактерий и свободноживущих инфузорий малых водоемов Самарской Луки // Под ред. д.б.н. В.В. Жарикова. Тольятти: ИЭВБ РАН. 2007. 193 с.
  8. Лейн А.Ю., Глущенко Н.Н., Осипов Г.А., Ульянова Н.В., академик Иванов М.В. Биомаркеры сульфидных руд современных и древних “черных курильщиков”. ДАН, 1998. Т. 359. № 4.
  9. Кожевин П.А.Микробные популяции в природе. М: Изд-во Моск. ун-та, 1989. 175 с.
  10. Осипов Г.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов // Патент РФ № 2086642. С12N 1/00, 1/20, C12Q 1/4. Приоритет от 24 дек. 1993. Опубл. 10.08.1997.
  11. Осипов Г.А., Назина Т.Н., Иванова А.Е.Изучение видового состава микробного сообщества заводняемого нефтяного пласта методом хромато-масс-спектрометрии // Микробиология, 1994. Т.63. Вып. 5. С. 876-882.
  12. Турова Е.С., Осипов Г.А.Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации  минералов железа в каолине // Микробиология. 1996. Т. 65. № 5. С. 682-689.
  13. Филина Н.Ю.Биология и экология бактерий, образующих магнитоупорядоченные соединения: Автореф. дис. … канд. биол. наук. М.: МГУ, 1997. 24 с.
  14. Чертов Н.В.Бентосные микробные сообщества водных экосистем // Мат-лы Всерос. науч. конф. «Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем: проблемы и перспективы гидробиологии и ихтиологии в XXI веке». Саратов: Изд-во Сарат. ун-та,  2001. С. 178-184.
  15. Шерышева Н.Г., Осипов Г.А.Таксономическая характеристика железовосстанавливающего микробного сообщества, окисляющего метан в донных отложениях озера Бездонное // Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения:  Матер. междунар. науч. конф. Ч. II. Пенза: ПГПУ. 2008. С. 173-175.
  16. Шерышева Н.Г.Таксономическая характеристика эколого-трофической группы железовосстанавливающих бактерий сообщества озерного ила, окисляющих водород // Тез. докл. Х Съезда Гидробиол. общества при РАН. Владивосток: Дальнаука, 2009. С. 445-446.
  17. Шерышева Н.Г., Осипов Г.А.Трансформация структуры микробного сообщества в восстановительном процессе в донных отложениях озера Серебрянка (Самарская Лука) // Известия Самарского НЦ РАН. 2013. Т. 15. № 3 (1). С. 489-496.
  18. Amdur B.H. Archivs Oral Biology. V. 23. P. 23-29.
  19. BÜhring S.I., Elvert M., Witte U.The microbial community structure of different permeable sandy sediments characterized by the investigation of bacterial fatty acids and fluorescence in situ hybridization  // Environ. Microbiol. 2005. V. 7, № 2. P. 281-294.
  20. Chemical Methodsin Bacterial Systematics // Eds M. Goodfellow. D.E. Minnikin. New York; London. 1985.
  21. Fautz, 1979
  22. Goodfellow M. and MinnikinE. Chemical Methods in Bacterial Systematics. (Eds.) Acad. Press, London -Toronto, статья Kropenstedt, 1985.
  23. Kaneda T.Fatty acids in the genus bacillus: an example of branched chain preferences // Bacteriol. Rev. 1977. 41. P. 391-418.
  24. Kaneda T.Iso- and anteiso-fatty acids in bacteria: biosynthesis, function and taxonomic significans // Microbiol. Rev. 1991.Vol. 55. № P.288-302.
  25. Lechevalier M.P.Lipids in bacterial taxonomy — a taxonomist’s view. // CRC Crit. Rev. Microbiol., 1977. V.5 № P. 109-210.
  26. McNabb A., Shuttleworth R., Behme R. et al.Fatty acid characterization of rapidly growing pathogenic aerobic actinomycetes as a means of identification.  J.Clin.Microbiol. 1997. V.35. № P.1361-1368.
  27. Moss C.W., Dees S.R. Identification of microorganisms by  gas chromatographic — mass spectrometric analysis of cellular fatty acids // J. Chromatography. 1975. V. 112. P.595-604.
  28. Nichols P.D., Mancuso C.A., White D.C.Measurement of methanotroph and methanogen signature phospholipids for use in assessment of biomass and community structure in model system.  Org.Geochem.1987.V.11. № 6. P.451-462.
  29. “Sherlock”, Microbial identification system. Database on microbial cellular fatty acids. MIDI Inc. Delavare, 1994.
  30. Spring St., Schulze R., Overmann J., Schleifer K-H.Identification and characterization of ecologically significant prokaryotes in the sediment of freshwater lakes: molecular and cultivation studies / FEEMS Microbiology Reviews, 2000. V. 24. P. 573-590.
  31. ОсиповГ.А. Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ. Дисс. Доктора биологических наук. Москва, 1996
  32. Vainshtein M., Hippe H., Kroppenstedt R.M.Cellular fatty acid composition of  Desulfovibrio species and its use in classification of sulfate-reducing bacteria // System. Appl. Microbiol. 1992. V.15.  P. 554-556.
  33. Verkhovtseva N.V., Osipov G.A., Bolysheva T.N., Kasatikov V.A., Kuzmina N.V., Antsiferova  Ju. and Alexeeva A.S.Comparative Investigation of Vermicompost Microbial Communities; In: “Microbiology of Composting”/ Ed. H. Insam, Springer-Verlag,GmbH&Co.KG, Berli, Heidelberg, New York. 2002. Р. 91-111.
  34. Villanueva L., Navarrete A., Urmneta J., White D.C., Guerrero R.Physiological status and microbial diversity assessment of microbial mats: The signature lipid biomarker approach / Ophelia, 2004.V. 58, № 3. P. 165-173.
  35. White D.C.Validation of quantitative analysis for microbial biomass, community structure, and metabolic activity // Adv. Limnol., 1988. № 31. P. 1-18.
  36. Zhukova N.V., Tarasov V.G.Microbial community structure in sediments of Vostok and Nakhodka Bays (Sea of Japan) // Abstract of the International Workshop on the Global Change Studies in the Far East, Vladivostok, Okt 2-3, 2002. Vladivostok, 2002. C. 136-139.

 

 

Studying composition of microbial communities in the sediments of water ecosystems by fatty acid markers

DETERMINATION of composition MICROBIAL COMMUNITIES OF BOTTOM WATER ECOSYSTEMS by FATTY ACID MARKERS

© 2014 г. N.G. Sherysheva *,**, G.A. Osipov **,  V.V. Khalko***

* Institute of  Еcology of  the Volga River basin of the RAS,  445003 Togliatti, Komzina str., 10,  Russia

** Group of Academician Y.F. Isakov, Bakoulev Center for Cardiovascular Surgery, Academy of Medical Sciences, 121552 Moscow,  Rublevskoe shosse, 135,  Russian

***Institute for Biology of Inland Waters RAS, 152742  Borok,

Structure and function of microbial communities in the sediments of aquatic ecosystems have been considered by using molecular method of gas chromatography spectrometry (GC-MS). Specific substances of microbial origin were discovered in the samples and assigned to most probable genera or species. Local bank have been designed  to lake silts microbial markers. The composition of microbial community were quantitative determined  by using algebra algorithm of decomposition the total fatty acids profile into individual taxonomic components.

Keywords: microbial community, gas chromatography – mass spectrometry, taxonomic composition, fatty acid markers, lake sediments

Комментировать