Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма человека с использованием метода хромато-масс-спектрометрии

Скачать оригинал

Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов*, А.А. Гонтова,

Г.А. Осипов, Н.И. Сарматова

Сибирский федеральный университет, Россия 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 1

Показана возможность использования метода хромато-масс-спектрометрии для оценки микроэкологического статуса организма человека по масс-спектрометрии микробных маркеров, в качестве которых выступают жирные кислоты, стерины, альдегиды. По анализу жирных кислот методом ХМС можно количественно определять наличие 57 микроорганизмов в ротовой полости человека.Received 16.11.2009, received in revised form 7.12.2009, accepted 15.12.2009

Ключевые слова: микроэкологический статус, метод определения микроэкологического статуса, ГХ-МС-метод.

Применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы определения микроэкологического статуса организма человека, а также диагностики инфекций имеют определенные ограничения и не- достатки. Например, существенным недо- статком классического бактериологическо- го исследования, помимо дороговизны и длительности (7-10 дней), является невоз- можность оценить роль некультивируемых микроорганизмов, прежде всего анаэробов в инфекционно-воспалительном процессе. Используемый в качестве дополнительного к классическому иммуно-серологический ме- тод непрямой, поскольку выявляет не возбу- дителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации.

Известные молекулярно-биологические ме- тоды, при несомненных преимуществах — прямое определение возбудителя, высокие специфичность и чувствительность, уни- версальность, скорость, возможность диа- гностики хронических и латентных инфек- ций, – имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные резуль- таты и невозможность адекватной количе- ственной оценки [1].

* Corresponding author E-mail address: AEfremov@sfu-kras.ru

1 © Siberian Federal University. All rights reserved

 

Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов,.. Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма…

 

 

Из всего вышесказанного вытекает оче- видная востребованность в надежном коли- чественном экспресс-методе диагностики дисбактериозов и определения возбудите- лей инфекции. Такими свойствами облада- ет метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), основанный на количе-ственном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альде- гидов, спиртов и стеринов) непосредствен- но в клиническом материале [1-3]. В этом принципиальное отличие метода, придаю- щее ему качественно новое свойство – воз- можность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров, что позволяет оценить вклад от каждого из сотен видов микроорганизмов, которые обитают, напри- мер, в кишечнике. Метод является высоко- чувствительным, быстрым (2,5 ч на пол- ный цикл исследования), универсальным, экономичным и имеет широкий диагно- стический спектр. Внедрение ГХ-МС дает возможность сократить время и стоимость исследования, минуя стадии  повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. Ме- тод позволяет не только определять маркер- ные вещества (жирные кислоты, альдеги- ды, спирты и стерины) в чистых культурах микроорганизмов, выделенных из клиниче- ского материала по известной технологии, но и количественно устанавливать состав микробного сообщества, который кроется за набором маркеров конкретной пробы. Материалом для исследования служат лю- бые биологические жидкости (кровь, слюна, моча, ликвор и т.д.) [2].

К настоящему времени состав жирных кислот большинства микроорганизмов изу- чен, показана его воспроизводимость, дока- зана их родо- и видоспецифичность. Метод детектирования микроорганизмов по ЖК- маркерам сходен с генетическим анализом (ПЦР, определение последовательности ну- клеотидов 16sРНК и пр.), поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего

синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК. Другими словами, профиль ЖК так же консервативен, как и строение ДНК. Иссле- дования в области бактериальной палеонто- логии подтвердили постоянство состава ЖК отдельных микроорганизмов и пула их жир- ных кислот, в целом, с глубины времен в 2,5 млрд лет.

В данной работе мы продемонстрируем возможности метода ХМС для оценки ми- кроэкологического статуса и диагностики ин- фекций организма человека на примере мазка ротовой полости человека.

Известно, что бактериям свойственно большое разнообразие ЖК и жирных альде- гидов. В настоящее время их насчитывают более двухсот пятидесяти. В организме че- ловека их всего около двадцати пяти. Это обстоятельство определяет возможность родового или видового анализа инфекций и дисбиозов на преобладающем фоне биологи- ческой жидкости непосредственно в клиниче- ском материале.

Наиболее часто встречающиеся в кли- нических пробах ЖК альдегиды и стерины перечислены в табл. 1 с отнесением к вероят- ным таксонам микроорганизмов [1-2].

Аналогичные зависимости обнаружены для гидроксикислот, спиртов, альдегидов и стеринов [1, 2, 4, 5].

Метод МСММ был применен нами для оценки микроэкологического статуса че- ловека по количественному определению индивидуальных микробных сообществ ротовой полости практически  здоровых лиц юношеского возраста обоего пола. По- лученные в ходе исследования результаты сравнивались с аналогичными показате- лями баз данных, включающих сведения о составе жирных кислот штаммов бактерий, вирусов и микроскопических грибов [6, 7].

Таблица 1. Высшие жирные кислоты в составе клеточной стенки с отнесением к микроорганизмам, у которых они наиболее часто встречаются*

Обозначение** Название Микроорганизмы
Жирные кислоты
1 С10 Декановая Streptococcus
2 i11 Изоундекановая Stenotrophomonas,
3 C12:0 Лауриновая Arcobacter,
4 iC12 Изолауриновая Peptostreptococcus anaerobius
5 iC13 Изотридекановая Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus subtilis,
6 а13 Антеизотридекановая Bacillus cereus, Brevibacterium
7 13:0 Тридекановая Selenomonas
8 i14 Изомиристиновая Streptomyces, Bacillus, актинобактерии
9 14:1∆9 9,10- тетрадеценовая Clostridium, Streptococcus pneumonia
10 14:1∆11 11,12-тетрадеценовая Simonsiella, Nocardia, Kingella kingae
11 14:0 Миристиновая Lactobacillus, Helicobacter, Campylobacter, Streptococcus, Clostridium
12 2Me14 2-метил-тетрадекановая Mycobacterium gordonae
13 i15:1 Изопентадеценовая Flavobacterium
14 15:1∆9 9,10-пентадеценовая Clostridium propionicum, Bacteroides hypermegas
15 i15 Изопентадекановая Propionibacterium, Bacteroides
16 а15 Антеизопентадекановая Staphylococcus, Bacillus, коринеформные бактерии
17 15:0 Пентадекановая Большинство видов микроорганизмов, минорный компонент, Selenomonas, Clostridium sporogenes, Bacteroides succinogenes, Bact. ruminicola, Pseudomonas stutzeri
18 i16:1 Изогексадеценовая Desulfovibrio
19 16:1∆7 7,8-гексадеценовая Clostridium ramosum, Streptococcus
20 16:1∆9 9,10-гексадеценовая Большинство видов микроорганизмов
21 16:1∆11 11,12-гексадеценовая Ruminococcus
22 i16:0 Изопальмитиновая Streptomyces, Nocardiopsis,
23 10Ме16 10-метилгексадекановая Rhodococcus
24 16:0 Пальмитиновая Большинство видов микроорганизмов
25 i17:1 Изопентадеценовая Campylobacter mucosales
26 17:1 Гептадеценовая Mycobacterium, Candida albicans
27 i17:0 Изогептадекановая Bacillus, Propionibacterium, Prevotella
28 a17:0 Антеизогептадекановая Corynebacterium, Bacteroides, Nocardiopsis, Nocardia
29 17сус Циклогептадекановая сем. Enterobacteriaceae
30 17:0 Гептадекановая Большинство видов микроорганизмов, минорный компонент
31 18:4 Октадекатетраеновая Некоторые грибы и дрожжи
32 18:3 Линоленовая Грибы и дрожжи
33 18:2 Линолевая Грибы, дрожжи, простейшие
34 18:1∆9 Олеиновая Все организмы
35 i18:1 H Enterococcus faecalis
36 18:1∆11 Цис-вакценовая Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Cardiobacterium hominis
37 18:0 Стеариновая Многие микроорганизмы

 

 

38 i18 Изооктадекановая Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Nocardiopsis, Bacillus subtilis, Clostridium difficile
39 10Me18 10-метил-октадекано- вая, (туберкулостеари- новая) рр. Mycobacterium, Nocardia; вв. Corynebacterium bovis,

C. гр. xerosis, C.urealyticum,

40 11Me18:1 11-метилоктадеценовая Afipia, Helicobacter mustelae
41 19cyc Циклононадекановая Lactobacillus, Enterococcus, Pseudomonas, Brucella, Campylobacter, сем. Enterobacteriaceae, Helicobacter pylori
42 i19 Изононадекановая Bacillus subtilis, Bacteroides hypermegas
43 а19 Антеизононадекановая Staphylococcus
44 19:0 Нонадекановая Nitrobacter, Bacillus, Serratia; Burkholderia cepacia
45 i19:1 Изо-нонадеценовая Afipia
46 20:1 Эйкозеновая Propionibacterium jensenii, , Streptococcus thermophilus, St. salivarius, St. mutans,

Actinomyces

47 20:0 Эйкозановая Actinomyces
48 20:1∆11 11-эйкозеновая Streptococcus mutans
49 21:0 Бегеновая Francisella
50 22:6 Докозагексеновая грибы, эукариоты
51 22:0 Докозановая Francisella
52 С22:4 Арахидоновая кислота Простейшие и высшие организмы
53 24:0 Тетракозановая Francisella, Mycobacterium, микроэукариоты
54 25:0 Пентакозановая Микроэукариоты
55 26:0 Гексакозановая Mycobacterium, микроэукариоты

* Вещества приведены в порядке возрастания числа атомов углерода в цепи молекулы, что соответствует хроматографическому времени удерживания

** Обозначения веществ: 17:1 — 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия — число двойных связей; а,i — в начале означает разветвление.

Материалом для  исследования служили мазки со слизистой зева, взятые у 19 кли- нически здоровых людей в возрасте 18-20 лет. Материал собирали стерильным ват- ным тампоном, помещали в транспортную угольную среду Эймса и доставляли в лабо- раторию не позднее 24 ч. При подготовке к хромато-масс-спектрометрическому анали- зу пробу на ватном тампоне высушивают c добавлением равного по объему количества метанола и подвергают кислому метанолизу в 1М HCl в метаноле. Метанолиз проводят в 0,4 мл реактива на 10 –15 мг сухого остат- ка в течение 1 ч при 80 °С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроор- ганизмов и других клеток жидкости в виде метиловых эфиров и диметилацеталей. Эти компоненты экстрагируют гексаном (400 мкл) в течение 5 мин, гексановый экстракт высушивают, а сухой остаток обрабаты- вают 20 мкл  N,О-бис(триметил-силил)- трифторацетамида в течение 15 мин при 80 °С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот и стеролов. К реакци- онной смеси эфиров добавляют 80 мкл гек- сана, и 1-2 мкл раствора вводят в инжектор ГХ-МС системы.

Хроматограмма жирных кислот и других продуктов жизнедеятельности микробных со- обществ приведена на рисунке, а ее обработка в пересчете на индивидуальные микробы – в табл. 2.

Рис. Типичная хроматограмма жирных кислот мазка ротовой полости здорового человека по выделенным ионам

По результатам проведенной серии ана- лизов установлено, что нормальная микро- флора ротовой полости здоровых молодых людей возраста 18-20 лет, проживающих в Красноярске, выглядит следующим образом: преобладают такие группы микроорганизмов, как Streptococcus, Mycobacterium/Candida, Actinomyces viscosus, микроскопические гри- бы, ситостерол.

По литературным данным общая обсе- мененность микробных сообществ должна составлять 6168 кл/г*105. А по результатам полученных экспериментов практически у  16 пациентов значение общей обсемененно- сти превышает эту величину в 2 раза, варьи- рует от 6807 до 16233 кл/г*105.

Интересно отметить, что после курса масляных ингаляций 3 %-м пихтовым мас- лом картина миклофлоры через 2 ч воздей- ствия изменилась, отмечено существенное подавление роста Streptococcus, Clostridium ramosum, Lactobacillus, Clostridium perfringens, Nocardia asteroides, цитоме- галовируса, микра грибов, ситостерола, Actinomycetes 10Me14. Неизменным осталось количество Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium/Str.  Pneumonia, Cl.difficile, Prevotella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus mutans, Herpes, E.lentum 7741 (группа В), Actinomyces viscosus.

Таблица 2. Результаты исследования микробных маркеров в мазке зева методом хромато-масс- спектрометрии, проба до и после обработки эфирным маслом

Из полученных результатов можно сде- лать вывод, что эфирное масло нормализует микрофлору ротовой полости, в отличие от антибиотиков не угнетает общий рост микро- флоры, действует более мягко, не раздражая слизистую [8, 9].

Проведенная оценка микрофлоры зева здоровых лиц юношеского возраста показа- ла широкий диапазон аэробных и анаэроб- ных микроорганизмов, общее количество которых превышает норму, принятую для здоровых людей средней полосы России. Следовательно, метод газовой хромато- графии – масс-спектрометрии позволяет изучить видовой состав микроорганизмов, населяющих микробиоценозы человека раз- личных биосубстратов. Полученные резуль- таты исследования состава микробных мар- керов в мазке зева практически здоровых лиц юношеского возраста дадут возмож- ность использовать эти данные в качестве контрольных значений в дальнейших иссле- дованиях, а также решать вопросы профи- лактики, выявляя носительство патогенной микрофлоры и формируя группы риска по развитию определенных заболеваний.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИР № 1.3.09, проводимой по заданию Фе- дерального агентства по образованию.

Список литературы

  1. Минорные жирные кислоты биологических жидкостей урогенитальных органов и их значимость в диагностике воспалительных процессов / Крымцева Т.А., Осипов Г.А., Бойко Н.Б., Соколов Я.А., Демина А.М., Радюшина Т.В., Осипов Д.Г. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 2. С.92-101.
  2. Осипов Г.А., Парфенов А.И., Верховцева Н.В., Ручкина И.Н. и др. Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально– биохимическим и хромато–масс–спектрометрическим методами //Эксперим. и клинич. гастроэнтерология. 2003. №4. С.59–62.
  3. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. М.: Химия, 256с.
  4. ОсиповГ.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов

// Патент РФ № 2086642. С12N 1/00, 1/20, C12Q 1 /4. Приоритет от 24 дек.1993 г.

  1. Осипов Г.А., Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах // Вестник РАМН. Т.13.

№2. С. 52-59.

  1. Воробьев А.А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: учебник. М., 224с.
  2. Koroch A.R., Juliana H.R. Bioactivity of essential oils and their components // Flavours and Fragrances. 2005.
  3. Стецюк О.У. Зависимость фармокодинамических параметров антибиотиков от условий определения чувствительности бактериальных возбудителей внебольничных и госпитальных инфекций: дисс. … канд. биол. наук. Смоленск,
  4. Хуснутдинова Л.М. Микрофлора слизистой оболочки миндалин человека в  норме при патологии // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.

Комментировать