Новые подходы к анализу инфекционных послеоперационных и посттравматических осложнений

Скачать оригинал

Осипов Г.А. Бойко Н.Б.

Детская городская клиническая больница № 13 им.Н.Ф.Филатова

Москва, Россия

Исследовано более двухсот случаев септических состояний и раневой инфекции, в том числе 25 детей с перитонитом из Московского Центра детской хирургии, около 50 анализов микст-инфекции при инфекционном эндокардите в НЦ ССХ им А.Н.Бакулева. Остальное – исследование ликвора при  гнойном менингите, биоптатов и экссудатов при послеоперационных осложнениях, выявление токсических агентов в крови при септических состояниях у детей Филатовской и Морозовской больниц г. Москвы.

Сепсис и инфекция в области хирургического вмешательства представляют собой сложные патологические процессы, лечение которых проблематично в хирургических стационарах и отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). Существенным препятствием в понимании микробной этиологии этих состояний является ограниченность информации, реально поступающей из лабораторий клинической микробиологии об общем  микроэкологическом статусе больного и  характере инфекции в очаге поражения. Причиной является то, что научные исследования и клиническая практика довольно долго движутся параллельными, не пересекающимися, путями. Известно, что микробиота человека и окружающей его среды одинакова и содержит сотни, если не тысячи, клинически значимых микроорганизмов. В то же время, в реальной процедуре оказания помощи больным с инфекционным поражением учитывается лишь десяток аэробных бактерий, а в качестве грибов подразумевается лишь род кандида, который на самом деле является дрожжами (а видов грибов насчитывается 1,5 миллиона на сегодня). Считается доказанным, что даже при оптимальной организации лечебного процесса количество нозокомиальных инфекций может быть снижено не более чем на одну треть, а применение антибиотиков с целью профилактики нозокомиальных инфекций оказывается неэффективным (Белобородов, 2002). Отмечается, что антибиотикотерапия (АБТ) должна быть этиотропной, потому, что отсутствие конкретных данных, указывающих на этиологию возбудителя, резко снижает эффективность эмпирической терапии и требует применения комбинации препаратов для максимального расширения спектра антимикробной активности.  На самом деле клинически значимыми, то есть, потенциальными агентами инфекции являются все микроорганизмы, как по существу их физиологии (по определению), так и по фактам, известным из литературы. Современные средства Интернет позволяют легко в этом убедиться. По каждому представителю микробиоты человека найдется хотя бы одно (чаще – десятки) документированных свидетельств его участия в инфекционном процессе. Если учесть, что микробиота человека преимущественно состоит из анаэробов, то очевидно, что решением перечисленных выше проблем является учет анаэробов в этиологии сепсиса и раневой инфекции с соответствующей модификацией антибиотикотерапии (Брискин, 2004; Гельфанд, 2004).

Не вызывает сомнений также смешанный характер инфекции, объединенной в биопленку. Тем не менее, в практике еще существует представление о моноэтиологичности воспалительных процессов. Наиболее отчетливо это проявляется в отношении менингита, при котором особо актуальными считают два возбудителя: Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis, а также Listeria monocytogenes и грибы рода Candida в случае гнойного менингита у пациентов с иммуносупрессией. При нейрохирургических операциях или вмешательствами на ЛОР-органах возрастает актуальность стафилококков и стрептококков. Здесь тоже упоминаются только удобные в культивировании микроорганизмы и игнорируется современный опыт в исследовании микробной этиологии менингитов.

При септических состояниях выбор антибиотиков является достаточно сложным. Это связано с тем, что сепсис является фазой основного инфекционного процесса: абдоминальной инфекции, пиелонефрита, инфекций мягких тканей и других. В таких случаях отсутствие микробиологических данных по основному заболеванию, затрудняет диагностику сепсиса. Полиморфизм сепсиса и ограниченность специфической клинической симптоматики не позволяют с высокой степенью вероятности предположить этиологию заболевания. Не эффективен посев крови на стерильность, поскольку в ней по определению мала вероятность обнаружения жизнеспособных клеток, а инфекционные токсины присутствуют.

Сегодня уже есть возможность разрешить вопросы микробной этиологии сепсиса и раневой инфекции, если наряду с методами классической микробиологии привлечь современные, более тонкие и универсальные по отношению к природе микроорганизмов методы – по молекулам-маркерам бактерий (масс-спектрометрию, полимеразную цепную реакцию) или по их специфическим метаболитам (хроматографию).

Новое направление в молекулярной  микробной диагностике – определение микст-инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов по специфическим маркерам (жирным кислотам, альдегидам и стеролам) с помощью хромато-масс-спектрометрии позволяет быстро и надежно определять малые доли веществ микробного происхождения в любых биологических средах организма человека. Этот метод микробиологического исследования быстр и универсален, поскольку не требует выращивания отдельных микроорганизмов на специальных средах и проведения для каждого из них специальных биохимических тестов для определения вида возбудителя (Осипов, 1996; Хабиб, 2004). Точное количественное определение микроорганизмов способствует назначению целенаправленной антибактериальной терапии и оперативному контролю ее эффективности. Он зарегистрирован Росздравнадзором в качестве новой медицинской технологии (Разрешение ФС № 2010/038 от 24 февраля 2010 года). Метод масс-спектрометрии, в отличие от применяемого в обычной практике посева клинического материала на культуральные среды, позволяет получить информацию о «замаскированной» части микст-инфекции, состоящей из некультивируемых в условиях лабораторий клинической микробиологии микроорганизмов. По сравнению с традиционными методами бактериологического исследования использование хемодифференциации с помощью ГХ-МС позволяет значительно сократить время исследования до 2,5 часов и и снизить его стоимость, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны и трудоемки для анаэробов.

Материалы и методы. Режим анализа состоит в следующем (Бойко, 2009). Биоптат ткани, кровь или раневое отделяемое в количестве 0,04 г подвергают кислому метанолизу  в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение одного часа при 80°С. В результате реакции метанолиза жирные кислоты, входящие в состав сложных липидов пробы, освобождаются в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагируют 200 мкл гексана, высушивают и обрабатывают в 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80 °С для получения триметилсилильных эфиров гидрокси-кислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводят в инжектор ГХ-МС системы HP-5973 Хьюлетт-Паккард (США). Для управления и обработки данных используют штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляют на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Хьюлетт-Паккард. Длина колонки 25м, внутренний диаметр 0.25 мм. Режим анализа — программированый, скорость нагрева термостата колонки — 7 град/мин в диапазоне 130 — 320°С.

Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрируют автоматически по заданной программе. Затем эти данные вводят в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL.

Ошибка количественных измерений численности микроорганизмов из-за погрешности в подготовке проб и анализа, несоответствия состава жирных кислот чистых культур банка данных и изучаемого сообщества in situ может составлять 20%.

Метод характеризуется следующими показателями:

Определение более 50 микроорганизмов одновременно в одном анализе при универсальности в отношении разных групп микроорганизмов: бактерии, грибы, вирусы. Время анализа составляет 2,5 часа, чувствительность 103-104 клеток в пробе, селективность – до вида. Анализ производится непосредственно в материале без высевания и подращивания; Не требует биологических и биохимических тестовых материалов – культуральных сред, ферментов, субстратов, праймеров и т.п.

Измеренные концентрации микробных ЖК подставляют блоком в шаблон электронной таблицы EXCEL  в которой автоматически происходит реконструкция количественного состава микст-инфекции в виде стандартной таблицы результатов, где полученные данные сопоставлены с нормой в табличной и графической форме. По выработанному ранее статистическому критерию (Beloborodova, 2000), отклонения от нормы приобретают клиническую значимость, когда численность микроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой.

Нами исследовано более двухсот случаев септических состояний и раневой инфекции, в том числе 25 детей с перитонитом из Московского Центра детской хирургии, около 50 анализов микст-инфекции при инфекционном эндокардите в НЦ ССХ им А.Н.Бакулева. Остальное – исследование ликвора при  гнойном менингите, биоптатов и экссудатов при послеоперационных осложнениях, выявление токсических агентов в крови при септических состояниях у детей Филатовской и Морозовской больниц г. Москвы.  При септических состояниях, лихорадках неясного генеза, чаще происходит избыточный рост ряда микроорганизмов из состава нормальной микробиоты хозяина, что по определению является инфекцией.  Общим признаком этой части пациентов является более чем двукратное превышение концентраций стафилококков, клостридий группы Clostridium ramosum, энтерококков, лактобацилл, Eubacterium lentum (Eggertella lenta) и дрожжей кандида. Наибольший прирост численности бактерий приходится на C. ramosum и лактобациллы. К частным признакам относится прирост численности основной группы эубактерий (Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum), который наблюдается не у всех обследованных детей. Частично участвуют в инфекционном процессе грамотрицательные микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus, Klebsiella и другие). Реже уровень клинической значимости превышают маркеры псевдомонад, моракселл, Fusobacterium/Haemophylus, Selenomonas, Helicobacter pylori  и превотелл. Другие грамотрицательные бактерии, такие как представители родов  Stenotrophomonas, Acinetobacter, Neisseria, Bacteroides, Burkholderia, Francisella обычно не превышают уровня клинической значимости или предела детектирования. У больных с раневой инфекцией или сепсисом наблюдается общий избыточный рост микробиоты по оценке микроэкологического статуса, при том обстоятельстве, что численность части микроорганизмов почти у всех обследованных снижается более чем в два раза по сравнению с нормой. Снижение относится, прежде всего, к бифидобактериям, пропионобактериям, энтерококкам и Clostridium propionicum. В некоторых случаях значимые снижения концентраций отмечены для лактобацилл, эубактерий, коринебактерий и микроскопических грибов (не кандида).

Таким образом, изменение в микроэкологическом статусе детей, перенесших шоковое состояние в результате травмы, операции или другой критической ситуации проявляются в увеличении численности одной группы бактерий – инфекция, воспаление – и снижение численности другой. Последнее явление составляет дефицитную составляющую разнополярного дисбактериоза, наблюдаемого у данной группы пациентов. Что касается инфекционной составляющей, то она, как и следовало ожидать, наилучшим образом выявляется при анализе материала из очага инфекции: соскоба, пунктата, экссудата. Если очаг закрыт, то информацию можно получить и из анализа крови. Сопоставление результатов двойного анализа – раневого экссудата и крови — для больного с инфекцией в области хирургического вмешательства показало что ведущими микроорганизмами (около 90% в раневом экссудате) являются анаэробы.  Это клостридии Clostridium ramosum и C. perfringens, пропионобактерии P.freudenreichii, эубактерии Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum, E. lentum и анаэробный актиномицет Actinomyces viscosus. Все они составляют нормальную (индигенную) микробиоту организма человека. Им сопутствует группа кокковых бактерий: стафилококки, стрептококки, энтерококки, которые обычно выявляют при классическом бактериологическом исследовании. Их доля в около 6%. Выше нормы концентрация микроскопических грибов кандида, актинобактерий Streptomyces, Nocardia, Rhodococcus и других, на долю которых приходится 7% общей инфекции. Минорную группу составляют грамотрицательные микроорганизмы: Moraxella, Pseudomonas aeruginosa, Fusobacterium (альтернативно – Haemophylus), Alcaligenes и Helicobacter pylori. Маркеров бактерий сем. Enterobacteriaceae  в экссудате не обнаружено (менее 105 клеток/мл).

Исследование пробы ликвора у ребенка с септическим менингитом, развившимся в результате черепно-мозговой травмы выявило 23 таксона микроорганизмов, маркеры которых имеют клинические значимое (более чем в два раза) превышение нормы. Обнаружено, что ведущими микроорганизмами воспаления мозга являются клостридии группы C. ramosum, а также C. propionicum и C. hystolyticum. Определенная по концентрации их маркеров численность самих микроорганизмов в зоне ликвора составляет 9.108 клеток/мл. На втором уровне микст-инфекции представлены актинобактерии (аэробные актиномицеты) родов Rhodococcus, Pseudonocardia и не идентифицированные, а также стафилококки, эубактерии (род Eubacterium), пропионобактерии, дрожжи кандида и микроскопические грибы. Их уровень концентрации имеет порядок 107. На порядок ниже, но тоже с избыточным ростом обнаруживаются маркеры бактерий сем. Enterobacteriaceae, превотелл, золотистого стафилококка, клостридий перфрингенс, хеликобактера, энтерококков, стрептококков, вирусов и анаэробных актиномицетов Actinomyces viscosus. Не обнаружены (менее 105) анаэробный пептострептококк, синегнойная палочка и бактероиды.

Представляет интерес как дополнение сведений о традиционно известной анаэробной клостридиальной инфекции (АКИ) анализ   экссудата гнойной раны живота. Всего найдено 24 таксона микроорганизмов, маркеры которых имеют клинические значимое (более чем в два раза) превышение нормы. Кроме C. perfringens ведущими микроорганизмами инфекции в зоне хирургического вмешательства являются клостридии группы C. ramosum, а также лактобациллы, руминококки, актинобактерии Nocardia, Actinomyces viscosus и дрожжи кандида (рис. 4). Численность доминирующих микроорганизмов в зоне раны составляет 1010 клеток/мл. На втором уровне микст-инфекции представлены стрептококки, стафилококки, энтерококки и коринебактерии. Их уровень концентрации имеет порядок 109.   Минорную группу составляют бактерии сем. Enterobacteriaceae, родов Pseudomonas и Moraxella, хеликобактер, фузобактерии и анаэробный пептострептококк. В табличной части рис 4 показано, что не обнаружены (менее 105) бактероиды.

Из систематических наблюдений следует, что наиболее часто изменения микроэкологического статуса организма при раневой инфекции и сепсисе связаны с избыточным ростом лактобацилл и клостридий группы С. ramosum c периодическим подключением многочисленных представителей рода  Eubacterium. Более чем вдвое растет концентрация маркеров Clostridium ramosum и актинобактерий Streptomyces, почти у всех больных возрастает количество E. lentum – до пятикратного превышения нормы. Clostridium perfringens не дает существенного абсолютного вклада в изменение микроэкологии больных в целом, кроме одного случая — гнойной раны живота, когда она доминирует в микст-инфекции (5,9х109 клеток/мл). Однако даже при малых абсолютных концентрациях C.  perfringens  нельзя недооценивать в патологическом плане: этот микроб образует как минимум 12 идентифицированных токсинов и энтеротоксин. Мишени для основных токсинов – биологические мембраны в различных тканях. Поражения обуславливают ферментативные процессы, катализирующие гидролитическое расщепление и нарушение клеточной проницаемости с последующим отеком и автолизом тканей, характерными для газовой гангрены.

Из экспериментальных данных следует, что измерение микробных маркеров in situ  выявляет новую группу микроорганизмов из числа трудно культивируемых, и поэтому, мало известных в клинической практике. Эти участники септического или раневого инфекционного процесса — клостридии, эубактерии, лактобациллы, хеликобактеры, стрептомицеты, родококки — обладают высокой патогенетической активностью. Она известна из специфически связанных с этими организмами нозологий, каждая из которых воспринимается сама по себе как серьезное заболевание, трудно поддающееся лечению. Клостридии групп перфрингенс и рамозум (группа RIC – ramosum, inocuum, clostridioforme) – это гангрена, эубактерии – септический артрит, лактобациллы – септицемия и эндокардит, H. pylory –язвенная болезнь желудка, языка и атеросклероз; стрептомицеты и другие актинобактерии — туберкулез, нокардиозы и актиномикозы.

По нашим данным наблюдений последних лет в 30% случаев в крови или раневом содержимом обнаруживается высокая концентрация маркеров эубактерий. Eubacterium – родственные клостридиям микроорганизмы, являющиеся одними из основных обитателей кишечника. Условные патогены с развитой системой видов и штаммов с универсальными свойствами. В том числе для них характерно индуцирование продукции провоспалительных цитокинов и TNF-alfa, а также противовоспалительного цитокина IL-10 (как ЛПС Грам — или клеточные токсины Грам+ патогенов). Это обуславливает их участие в патологиях тяжелых заболеваний, таких как, средиземноморская семейная лихорадка, эндокардит, врожденный порок сердца, кожные и кишечные патологии, связанные со сложным изменением концентрации их видов в биотопах.  Eubacterium lentum известен как микроорганизм, ассоциированный с ректальным раком и продуцирующий хориогонадотропин-подобный имунореактивный материал. Известен также как агент септического артрита и синуситов.

  1. pylory– микроорганизм, хорошо известный участием в микробной этиологии язвенной болезни, в последнее время обнаруживается и в других органах – полости рта, печени, прямой кишке, атеросклеротических бляшках. На этом фоне обнаружение H. pylori в других отделах пищеварительного тракта в норме и патологии не выглядит странным. Патогенность H. pylory известна: проникая через слизь, бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам, проникают в железы слизистой оболочки. ЛПС микроорганизмов способствует миграции нейтрофилов и развитию острого воспаления. Под действием бактериальной уреазы мочевина превращается в аммиак, повреждающий слизистую оболочку.

Родококки – факультативные внутриклеточные бактерии, способные персистировать и вегетировать в макрофагах и других клетках высших организмов, вызывая в конечном счете их разрушение. Результирующее действие родококков вызывает поражение тканей аналогичное микобактериям туберкулеза (Linder, 1997). Они вырабатывают   ферменты, гидролизующие липиды (например – холестеролоксидазу) которые токсичны для организма человека и животных. Биопсия тканей, пораженных родококками, выявляет многочисленные полиморфоядерные лейкоциты, вспученные клетки и каверны с внутриклеточными бактериями. Большинство штаммов родококков чувствительны к гликопептидным антибиотикам, включая ванкомицин и тейкопланин, и к рифампину. Макролиды, такие как эритромицин и кларитромицин также ингибируют рост многих штаммов. Родококки устойчивы к бета-лактамным (за исключением карбапенемов, особенно имипенема) антибиотикам, хотя это свойство не связано с продукцией бета-лактамазы. У имеющих контакт с домашними животными нередко причиной пневмонии и распада легкого является Rodococcus equi. Поскольку это внутриклеточный патоген, антибиотик должен проникать внутрь клеток. В таких случаях длительно применяют комбинацию эритромицина (или других новых макролидов) с рифампицином

В 55% случаях в наших наблюдениях за критическими больными в ОРИТ преимущественный количественный прирост обнаруживают лактобациллы. Действительно, по литературным данным они зафиксированы как возбудители при эндокардите, бактериемии, бактериурии, перитонитах, абсцессах и менингитах. Наиболее часто выявляются L. casei и L. rhamnosus (Cannon, 2005). Lactobacillus spp. были изолированы также из нарывов, при пневмонии, бактериемии и коньюктивитах.  Сообщается, что лактобациллы чувствительны к эритромицину, клиндамицину, гентамицину, цефотаксиму, амоксициллину, цефтриаксону, ампициллину, ампициллин-сулбактаму, пенициллину-G, но устойчивы к ванкомицину. Отмечается синергический эффект терапии пенициллинами с аминогликозидами. Факторами патогенности лактобацилл считают продуцируемые ими гликозидазы и протеазы.

Приведенные данные подтверждают существующее суждение о патогенетическом участии в септическом процессе микроорганизмов кишечника, заполняя тем самым пробелы в представлении о том, какие именно таксоны микроорганизмов в нем участвуют, в каком количественном выражении и как часто. Хотелось бы надеятся что  эта информации послужит поводом для расширения понятия эндотоксикоз при сепсисе и/или инфекции в области хирургического вмешательства (Ерюхин, 1995) путем включения в  число продуцентов токсинов грамположительных бактерий – основных обитателей кишечника: эубактерий, лактобацилл, клостридий, пропионобактерий и актинобактерий в первую очередь. Популяции этих бактерии, как и все прочие микроорганизмы, при избыточном росте (инфекции) с наибольшей вероятностью вырабатывают токсигенные штаммы и провоспалительные факторы. Известно, что анаэробы являются основными обитателями организма человека. Их участие в раневой инфекции и сепсисе не вызывает сомнений, а доля участия приближается, по данным многочисленных работ, к их доле в его микроэкологическом статусе. Приведенные в настоящей работе данные подтверждают эту тенденцию. Принципы эмпирической АБТ также подтверждают участие анаэробов и актинобактерий, поскольку эффективным лечение становится тогда, когда в препараты выбора включен амоксиклав (действующий на клостридии и эубактерии) с метронидазолом, а также амикацин, к которому чувствительны практически все актинобактерии.ИАЦСПЕЦИАЛИСТОВ

Выводы. 1. Метод масс-спектрометрии микробных маркеров позволяет в одном опыте количественно определить разнородные микроорганизмы (аэробы, анаэробы, актинобактерии, грибы, вирусы) по молекулрным маркерам – жирным кислотам их клеточной стенки непосредственно в клиническом материале (кровь, раневое отделяемое, ликвор и т. п.) в течение трех часов с момента его поступления в лабораторию.

  1.  Доминантами при инфекции в области хирургического вмешательства и сепсисе являются грамположительные анаэробы (клостридии, лактобациллы, эубактерии). Второй уровень по численности представляют актинобактерии родов Nocardia, Pseudonocardia, Rhodococcusи дрожжи Candida.  Далее по ранжиру следуют стафилококки, стрептококки, энтерококки и грамотрицательные микроорганизмы: энтеробактерии, псевдомонады, бактероиды и фузобактерии.
  2. Вопрос о выборе антибиотиков для большинства некультивируемых в клинической лаборатории микроорганизмов решается положительно путем использования литературных данных с выбором тактики лечения, приемлемой для конкретного больного.
  3. Экспрессность и точность анализа обеспечивает оперативный мониторинг процесса лечения.

 

  1. Белобородов В.Б. Проблема антибактериальной терапии инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии с позиций доказательной медицины. Consiliummedicum, -2002. — Том 4. – № 1
  2. Бойко Н.Б., Осипов Г.А., Белобородова Н.В., Курчавов В.А. Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и перитонеальном экссудате брюшной полости при гангренозно-перфоративном аппендиците. Инфекции в хирургии. Том 7, №2, с. 58, 2009.
  3. Брискин Б.С. Еще раз к вопросу о сепсисе.Инфекции в хирургии, Т. 2. № 4 с 33-36
  4. Гельфанд Б.Р., Руднов В.А., Проценко Д.Н., Гельфанд Е.Б., Звягин А. А., Ярошецкий А.И., Романовский Ю.Я.  Сепсис: определение, диагностическая концепция, патогенез и интенсивная терапия. Инфекции в хирургии, Т. 2, № 2
  5. Ерюхин И.А., Шашков Б.В. Эндотоксикоз в хирургической клинике, С.-Пб, изд. Логос, 1995, 304с.
  6. Осипов Г.А. Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах.  Вестник РАМН. -1996, Т.13,-№2,- С.52-59
  7. Хабиб      О.Н., Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Детектирование молекулярных маркеров бактерий в ткани клапанов сердца в норме и при патологии с применением метода газовой хроматографии и масс-спектрометрии.  Журн. Микроб. Эпидем. Иммун., 2004,  № 3: 62-68
  8. Beloborodova N.V., Osipov G.A.  Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship. Microb. Ecol.Heal.Dis., SCUP. — 2000.- Vol. 12. – P. 12-21.
  9. Cannon J. P., Lee T. A., Bolanos J. T., and Danziger L. H. Pathogenic relevance of Lactobacillus: a retrospective review of over 200 cases.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, — 2005; — Vol 24, N 1. – P. 31-40
  10. Linder R.Rhodococcus equi and Arcanobacterium haemolyticum: Two “Coryneform” Bacteria Increasingly Recognized as Agents of Human Infection. Emerging Infectious Diseases Vol. 3, No. 2, April–June 1997

Комментировать