Метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии в изучении микробных сообществ почв агроценоза

Скачать оригинал

Верховцева Надежда Владимировна,

д.б.н., профессор каф. агрохимии факультета почвоведения МГУ, Москва,

Осипов Георгий Андреевич,

д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева, Москва

 

В работе раскрыта методология молекулярного метода газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), используемого в изучении микробного сообщества почв. Рассмотрена история применения метода в экологии, суть и методика анализа, его возможности и достоинства по сравнению с другими молекулярными методами.

В ранних монографиях, изданных под редакцией Е.Н.Мишустина [1], указывается на то, что при изучении микробного населения почв, важно не столько общая численность микроорганизмов, сколько структура микробного сообщества. Представление о структуре возникает тогда, когда в системе, в частности в агроэкосистеме, выделяют различные элементы, анализируют их набор, количественное соотношение и взаимосвязи между ними. Наиболее часто в работах почвенных микробиологов фигурируют четыре основных подходa для характеристики структуры микробоценозов почв: функциональный, морфологический, таксономический и экологический [2], основанные на методе посева почвенной суспензии на питательные среды. Однако традиционные микробиологические подходы, связанные с использованием метода селективных сред, требуют много времени и профессиональных усилий микробиологов для выделения и идентификация до вида высеянных штаммов с использованием тестовых ферментаций и определения различных физиологических, морфологических и прочих характеристик, необходимых для их таксономического отнесения. Кроме того, определяемое разнообразие  бактериальных сообществ и численность микроорганизмов на два-три порядка ниже по сравнению с составом коллекций бактерий, определенных в этих же образцах молекулярно-биологическими методами [3,4], так как многие виды не культивируются на разработанных средах. В целом считают, что метод посева позволяет выделить только около 1% микроорганизмов от всего микробного разнообразия [3,5].

Наличие специфических веществ (маркеров) в клеточных компонентах и метаболитах микроорганизмов открывает возможность для направленного поиска и идентификации микроорганизмов в сообществах с использованием метода газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС). Установлено, что нечетные, разветвленные и циклопропановые жирные кислоты и жирные альдегиды встречаются исключительно у бактерий, а высшие жирные бета-оксикислоты присущи только грамотрицательным микроорганизмам. К настоящему времени состав жирных кислот большинства микроорганизмов изучен, показана его воспроизводимость, доказана родо- и видоспецифичность ЖК [6]. Метод детектирования микроорганизмов по ЖК-маркерам сходен с генетическим анализом (ПЦР − полимеразная цепная реакция, определение последовательности нуклеотидов 16sРНК и пр.), поскольку состав ЖК детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего синтеза ЖК по матричным РНК. Т.е, профиль ЖК так же консервативен, как и строение ДНК.

C метода маркера начаты работы группы американских исследователей под руководством Вайта [7], пришедшего впоследствии к изучению структуры микробных сообществ экологических проб [8] различных крупных групп микроорганизмов (например, грамотрицательных и грамположительных бактерий) и отдельных родов по известным маркерам без количественных определений видового состава сообщества. Подход Вайта впоследствии развит в расчетно-аналитический метод, позволивший определить качественный и количественный состав микроорганизмов в разных экологических местообитаниях [9,10] и методологически сформулирован в работе по исследованию сообщества каолина [11]. Результаты расчета подтверждены с помощью традиционных микробиологических методов. В агрохимических исследованиях в России метод впервые был применен для изучения микробного сообщества вермикомпостов и исходных субстратов, на основе которых они были получены [12].

Суть анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот, альдегидов и стеринов из подлежащего исследованию образца, их разделения на газожидкостном хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Поскольку хроматограф соединен в едином приборе с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных, сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени пробоподготовки и расчета данных − около 3-х часов. Его результатом является определение концентрации микробных маркеров и последующая реконструкция состава и структуры микробного сообщества.

Методу ГХ-МС микробных маркеров присущи следующие достоинства:

  • широкий диагностический спектр: определение маркеров десятков микроорганизмов одновременно в одной пробе;
  • универсальность: определение разных групп микроорганизмов: бактерий ( в том числе актиномицетов), грибов, вирусов;
  • экспрессность: время одного анализа не более 3 часов
  • высокая чувствительность: 0.01 нг/мл маркера
  • селективность: определение микроорганизма до вида при наличии маркера, характерного для данного вида
  • независимостьот оснащения микробиологической лаборатории и возможность прямого анализа клинических образцов без высевания и подращивания;
  • экономичность: метод не требует дорогих биологических и биохимических тестовых материалов, культуральных сред, ферментов, праймеров.

Итак, для проведения экспресс-анализа маркеров микроорганизмов требуются: хромато-масспектрометр, программа расчета и база данных искомых химических компонентов для возможных.

Образцы проб. Средние образцы почвы (50-100 г) или органических удобрений (навоза, торфа, вермикомпоста, осадка сточных вод и т.д.), отобранные в соответствии с правилами отбора средних проб для агрохимических анализов [13], высушивают до воздушно-сухого состояния и в таком состоянии хранят до проведения анализа. В зависимости от содержания в пробе органического вещества (Сорг ) навеска для исследования методом ГХ-МС составляет 0,1-0,8 г – чем больше в почве Сорг, тем меньше навеска.

Методика анализа. Из навесок экстрагируют липидные компоненты методом кислого метанолиза (КМ) в 0,4 мл 1М HCl в метаноле в течение одного часа при 80°С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот (ЖК) и альдегидов из сложных липидов. В результате получают ЖК в виде метиловых эфиров (МЭЖК) и альдегиды в виде диметилацеталей (ДМА). Далее эти компоненты экстрагируют, применяя 400 мкл гексана. Полученный экстракт высушивают при 800 С и сухой остаток обрабатывают 20-ю мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот, спиртов и стеринов. Далее 1-2 мкл полученной реакционной смеси разбавляют гексаном до 100 мкл и вводят для анализа в инжектор хромато-масс-спектрометра (далее ГХ-МС). Для количественных измерений в качестве внутреннего стандарта используют тридейтеро-тридеканоат.

Масс-фрагментография. Масс-спектрометр работает в режиме периодического сканирования от восьми до пятнадцати ионов в пяти интервалах времени. Интервалы и ионы выбраны таким образом, чтобы селективно детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов. В том числе, для детектирования малых количеств микробных кислот с длиной углеродной цепи С10-C24 в спектрах ЖК использован интенсивный ион с отношением массы (m) к заряду (z) m/z = 87. Для детектирования b-оксикислот взят ион 175, для которых он специфичен и характеризуется достаточной интенсивностью в спектре. Общим для альдегидов выбран ион 75 – максимальный в их масс-спектре. В итоге, для селективного детектирования маркерных веществ микроорганизмов используют программу с накоплением сигналов более 30-и ионов. Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрируют автоматически по специальной программе. Затем эти данные вводят в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL. Такой алгоритм детектирования масс-спектральных параметров пробы позволяет определять около двухсот известных ЖК, спиртов и стеролов микроорганизмов, что достаточно для выявления и количественного определения более 170 таксонов микроорганизмов на уровне рода, а иногда и вида.

Для количественного расчета используют данные калибровки по дейтерированной тридекановой кислоте и чистым культурам микроорганизмов.

Многие вещества из спектрах ЖК являются общеизвестными маркерами микроорганизмов. Например, (рис.1), присутствующая в пробе 3-окситетрадекановая кислота (b-оксимиристиновая), является широко известным

Рис.1. Участок селективной хроматограммы по специфическому иону 87 МЭЖК компонентом липополисахарида типа E.coli. Эта кислота характерна для всех бактерий сем. Enterobacteriaceae, а также Burkholderia cepacea, Geobacter humireducens и других. 2- и 3 -окси-додекановые кислоты характерных для грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas,  Acinetobacter и др. Кроме того, на рассматриваемом участке хроматограммы обнаруживаются пики, относящиеся к миристиновой, пентадекановой и пальмитиновой кислотам соответственно. Минорные пики между ними соответствуют их изомерам с метильными группами в концевых атомах углерода цепи ЖК (изо-, антеизо-) и в положениях С10, С12. Эти ЖК специфичны для большого числа бактерий и актиномицетов, то есть являются их маркерами.

Площадь пика маркера пропорциональна его концентрации, а, следовательно, концентрации соответствующего микроорганизма, которая определяется как число клеток N1 в единице объема или веса пробы по формуле:

N1=Ai[Mst/(q2*Msam*Ast)]/Ri1, где выражение в квадратных скобках, постоянный коэффициент:

к = Mst/q2/Msam/Ast = Mst(mg)/5,1×10(-15)g/Msam(mg)/Ast

В этих формулах Ai – площадь пика маркера, Mst – количество введенного в пробу стандарта в мг, Msam – соответственно, количество пробы, Ast — площадь пика стандарта, Ri1 – доля в % маркера с индексом i в профиле ЖК определяемого микроба с номером 1 (N1), q2 – коэффициент, равный 5,1×10(-15)g , в котором содержится основополагающая в пересчете на число клеток величина 5,9х1012 клеток микробов, содержащихся в 1г микробной биомассы, и процентное содержание ЖК в клетке, равное в среднем трем процентам.

Соответственно, число клеток любого следующего микроорганизма можно рассчитать по аналогичной формуле N2 = Ai x k / Ri2  и так далее, умножая площади пика Ai маркера, по которому проводятся вычисления, на коэффициент k и деля на содержание маркера (в %) в составе ЖК этого микроорганизма.

При расчете содержания грибов в сообществе микроорганизмов учитывают процентное содержание ЖК в клетке, равное в среднем тридцати процентам. Однако так как анализируется вся биомасса грибов без разделения на клетки мицелия и споры, при выражении конечного результата корректнее писать относительные единицы, а не кл/г почвы. Также поступают при расчете биомассы простейших, эукариотических организмов (почвенных животных) и растительных остатков.Такие результаты можно сравнивать по вариантам опыта. Для простейших в качестве маркера был выбран альдегид С18 (октадекановый альдегид), для животных – холестерол, для растительных остатков − ситостерол ( растительный стерол).

При необходимости провести сравнительную количественную оценку биомассы бактерий и грибов выражают ее в мкг/г почвы, т.е. не производят деления на соответствующие коэффициенты.

Хромато-масс-спектрометрический анализ.  Технология анализа отработана на хромато-масс-спектрометрах АТ 5973 D фирмы Agilent Technologies, (бывшая Hewlett-Packrd, Analytical division) США, и аналогичных приборах фирм Shimadzu и Micromass состоящих из собственно масс-спектрометра, соединенного с ним хроматографа, системы вакуумной откачки и ЭВМ с периферийными устройствами. Для реализации метода принципиально необходимо, чтобы ГХ-МС система обеспечивала работу в режиме селективных ионов (синонимы масс-фрагментография, Single Ion Monioring). Масс-спектрометр квадрупольный  с диапазоном масс 2-1000 аем, имеет разрешающую способность 0,5 аем во всем рабочем диапазоне. Чувствительность прибора 50 пг по метил-стеарату в режиме непрерывного сканирования и 1 пг. в режиме селективных ионов. Для анализа необходимо использовать кварцевые капиллярные колонки, например НР-5 ms, длиной 25-30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной слоя неподвижной фазы 0.2 мкм. Хроматографирование проводят в режиме  программирования температуры от 130 до 320оC со скоростью 5 град/мин. Температура инжектора 280, интерфейса 250оC.

Заключение. К методологическим аспектам использования молекулярного метода ГХ-МС для изучения почв агроэкосистем, в отличие от других молекулярных методов, можно отнести следующее. Метод позволяет не только определять маркерные вещества микроорганизмов в прямом анализе пробы почвы, как это делалось ранее, но и выявлять и количественно определять состав микробного сообщества, который кроется за набором маркеров конкретного образца. В этом принципиальное отличие метода, придающее ему качественно новое свойство – возможность разложения суперпозиции жирных кислот, альдегидов и стеринов – вклада от сотен видов микроорганизмов, составляющих микробный запас почв – на профили отдельных видов, определение доминирующих родов и видов при вычислении их количества. В этом сообществе, включающем 35-45 видов, доминируют 2-4 вида (их количество по отдельности составляет более 10% в сообществе, а в сумме − более 30 %). Именно эти виды определяют направленность микробиологических процессов в агроэкосистеме, обеспечивая анаэробно — аэробно равновесие, при условии обеспеченности выращиваемых растений необходимыми питательными элементами, главным образом азотом. Так ранее при использовании традиционных методов посева доминирующими видами в почвах агроэкосистем считались бациллы, а из анаэробных видов рассматривались только представители р.Clostridium. Это связано с разработанностью питательных сред для выделения этих микроорганизмов, на которых они хорошо выделяются. Метод ГХ-МС позволил показать, что доминирующими видами в дерново-подзолистой супесчаной почве

 

Литература.

  1. Микрофлора почв северной и средней части СССР/Под редакцией Е.Н. Мишустина. − М.: Наука, 1966.
  2. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. − М.: ИКЦ «Академкнига», 2002.
  3. Torsvik V., Goksoyr J., Daae F. // Aррl.Environ.Microbiol.− 1990. − Vol.56.
  4. Torsvik V., Sorhein R., Goksoyr J. // J. Indust.Microbiol. − 1996. − Vol. 17.
  5. White D.C. // Adv. Limnol. − 1988. − Vol.31.
  6. Stead, D.E., Sellwood, J.E., Wilson, J., et al. // J.Appl.Bacteriol. − 1992. − Vol. 72.
  7. Bobbie R.J., White D.C.// Appl. Environ. Microbiol. − 1980.− Vol.39.
  8. Nichols P.D., Mancuso C.A., White D.C. // Org.Geochem. − 1987. − Vol. 11. − No.6.
  9. Осипов Г.А. // Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов. //Патент РФ № 2086642. С12N 1/00, 1/20, C12Q 1/4. Приоритет от 24 дек.1993.
  10. Осипов Г.А., Назина Т.Н., Иванова А.И.// Микробиология. − 1994.− Т.63. − Вып.5.
  11.  Osipov G.A., Turova E.S. // FEMS Microbiol. Rev. − 1997. − Vol.20.
  12. Verkhovtseva N.V., Osipov G.A., Bolysheva T.N., Kasatikov V.A., Kuzmina N.V., Antsiferova E.Ju., Alexeeva A.S. /Microbiology of composting.− Berlin Heidelberg: Springer Verlag, 2002.
  13. Практикум по агрохимии /Под ред. В.Г. Минеева – М.: Изд-во МГУ, 2001.

Комментировать