Изучение транслокации кишечных микроорганизмов в суставы при посттравматических артритах у детей с применением масс-спектрометрии микробных маркеров

Прохорова Е.С., Выборнов Д.Ю., Бойко Н.Б., Федосова Н.Ф., Лядов К.В., Осипов Г.А.

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, кафедра детской хирургии

ФГУ  Лечебно-реабилитационный центр Росздрава

Детская городская клиническая больница № 13 им.Н.Ф.Филатова. Москва, Россия

 

Введение     

Разнообразие видов травм коленного сустава, особенности клинических проявлений в детском возрасте, требуют тщательного дифференцированного подхода к диагностике и лечению закрытых повреждений коленного сустава, особенно, когда речь идет о внутрисуставных повреждениях, в противном случае, возникают осложнения, приводящие к нарушению функций коленного сустава. [1,2,3,4,5,6,7,8].

Наличие пространственного фактора, образующего определенную отграниченную зону коленного сустава в период, как повреждения, так и репарации, является одной из принципиальных характеристик внутрисуставного посттравматического воспалительного процесса. Этот фактор предрасполагает к переходу воспалительного процесса в хроническую форму; также как и наличие в полости сустава оторванного костно-хрящевого фрагмента, постоянно ущемляющейся жировой подвески и других патологически измененных структур способствуют формированию рецидивирующих и хронических посттравматических синовитов. [9,10,11,12,13,14,15,16]

Бактериологическое исследование при синовитах обычно проводят с использованием посева пунктата из коленного сустава на питательные среды для выявления роста микроорганизмов с последующей идентификацией в чистой культуре (в аэробных, анаэробных условиях). Основным недостатком этого метода является невысокая  частота выделения культуры, т.е. его низкая чувствительность. Даже при использовании последних достижений биотехнологии (высокочувствительных анализаторов гемокультур и многокомпонентных питательных сред) рост культуры можно получить лишь при наличии в исследуемом материале жизнеспособных бактерий. Кроме того, длительные сроки исполнения отдаляют начало адекватной терапии.

Применяемый в последние годы способ ДНК-гибридизации обладает высокой чувствительностью, но является узко специфичным и может лишь подтвердить или исключить одну из предполагаемых версий об этиологии инфекции, но не позволяет идентифицировать микроорганизмы при неизвестном возбудителе инфекционного процесса [17,18].

Для диагностики аналога СЖ – асцитической жидкости, применен метод, основанный на определении содержания короткоцепочечных жирных кислот — метаболитов анаэробных микроорганизмов. Его достоинством является высокая точность диагностики инфицированности содержимого анаэробными микроорганизмами, а недостатком низкая специфичность, невозможность количественной оценки содержания отдельных видов микроорганизмов.

Перспективным выглядит метод газовой хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС), который позволяют получить информацию о наличии в биологическом материале мономерных химических компонентов микробной клетки и ее метаболитов [19,20,21]. Выявление широкого спектра возбудителей инфекции осуществляется без предварительного посева исследуемого биологического материала [22,23]. В частности в упоминавшейся асцитической жидкости при спонтанном бактериальном перитоните, где была экспериментально подтверждена транслокация в брюшину большого числа микроорганизмов, в том числе специфичных для кишечной микробиоты [24,25].

Целью настоящей работы является попытка выявления этим методом микробных агентов посттравматических артритов у детей посредством параллельного измерения концентрации их маркеров в  синовиальной жидкости и крови.

Материалы и методы исследования

За 2008 г через отделение травматологии и ортопедии ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова прошло 79 больных (100 %) с посттравматическими артритами коленных суставов и их последствиями, среди которых острая патология составила 45 детей (55,7 %), из них 5 случаев с неустановленной этиологией заболевания, хроническая – 39 детей (44,3%), из них 13 случаев с неустановленной этиологией заболевания. В структуре патологии преобладали мальчики — 42 ребенка (53 %), с одинаковой частотой поражения обоих коленных суставов, в то время как у девочек – 37 детей (47 %), патология правого коленного сустава встречалась в 2 раза чаще. Возрастная группа составила 5-16 лет, с наибольшей частотой встречаемости в 14 лет у обоих полов. По симптомам проявления посттравматического артрита у больных были выделены следующие группы детей: с гемартрозом -31, с синовитом – 32, с симптомом артрита и преходящих блоков коленного сустава – 16.

Всем детям было проведено комплексное обследование, включавшее в себя общеклиническое, лабораторные и инструментальные (R-графия, МРТ, КТ) методы, завершавшееся артроскопией. На доартроскопическом этапе диагностики данные обследований порой имели значительные расхождения, а проведение артроскопии позволило выявить патологический субстрат только у 77,2 % пациентов, в то время как у 22,8 % пациентов макроскопической причины синовита выявлено не было. Посевы синовиальной жидкости на среды давали отрицательный результат, а гистологическое исследование биоптатов синовиальной оболочки выявило только общие признаки, характерные для воспалительного процесса (клеточная пролиферация, лимфогистиоцитарная инфильтрация, гиперплазия ворсин синовиальной оболочки). Забор гистологического материала производился из разных областей сустава вне зависимости от локализации травмы, в то время как проявления воспалительного процесса были обнаружены во всех областях.

Детям с различными симптомами проявления посттравматического артрита (n=20, случайная выборка) с целью обнаружения химических компонентов – маркеров потенциальных возбудителей, содержащихся в данном биологическом субстрате было произведено исследование пунктата коленного сустава и крови из локтевой вены при помощи химического анализа методом газовой хроматографии – масс – спектрометрии в режиме масс-фрагментографии (ГХ-МС-МФ). Для анализа цельную кровь в количестве 40 мкл (синовиальная жидкость – 80 мкл) микропипеткой переносят в виал, емкостью 1,5 мл с подсушивают в термостате при 80ºС с добавлением 40 мкл метанола для ускорения сушки. К загустевшей пробе приливают 400 мкл 1М соляной кислоты в метаноле, завинчивают плотно крышкой и подвергают кислому метанолизу при  80ºС в течение 1 часа. К охлажденной реакционной среде добавляют 300 нг стандарта (дейтерометиловый эфир тридекановой кислоты), растворенного в гексане. Затем проводят экстракцию двумя порциями по 200 мкл гексана, встряхнув смесь на вортексе и позволяя ей отстоятся в течение 5 мин при комнатной температуре. Объединенный экстракт переносят в чистый виал, высушивают 5-7 мин при  80°С и сухой остаток обрабатывают 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80°С при  закрытой крышке. К реакционной смеси добавляли 80 мкл гексана и 2 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы AT-5973 (Agilent Technologies, США). Хроматографическое разделение пробы осуществляют на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Аджилент технолоджис длиной 25м и внутренним диаметром 0,25мм, газ-носитель — гелий. Режим анализа — программированный, скорость нагрева термостата колонки 7 ºС/мин в диапазоне 135 — 320ºС. Выдержка при начальной температуре 1,5 мин. Температура испарителя – 250ºС, интерфейса – 250 — 300ºС. Масс-спектрометр — квадрупольный, с ионизацией электронами (70 эв) используют в режиме селективных ионов, или масс-фрагментографии (МФ), при периодическом сканировании до тридцати ионов в пяти интервалах времени. Интервалы и ионы выбирают таким образом, чтобы селективно детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов.

Маркерами являются высшие жирные кислоты, альдегиды и стеролы — продукты распада микробных клеток вследствие их фагоцитоза, собственного автолиза отживших клеток и естественного лизиса микробных клеток ферментами. Универсальность метода ГХ-МС в отношении вида биологической пробы, возможность количественной оценки содержания маркера (а, следовательно, и микроба) и экспрессность анализа являются отличительными признаками метода. Методика разработана в расчете на определение широкого круга микробных маркеров (более 200 веществ) а, следовательно, и возбудителей воспалительных процессов и инфекций. Идентификация микроорганизмов, производится по наличию единичных маркеров, специфичных для данного таксона (рода, вида, группы), а также по их комбинации, количественному соотношению и материальному балансу отдельных химических веществ по специальной программе в таблицах EXCEL. Метод зарегистрирован Росздравнадзором за № 2010/038 от 24.02.2010.

Результаты измерений микробных маркеров в крови соответствуют гомеостатической колонизации кишечника и слизистых оболочек других органов, из которых микробные маркеры физиологическим путем способны попадать в кровь. Они соответствуют динамическому равновесию между живыми и мертвыми микроорганизмами в момент отбора пробы. Микробиота организма человека гомеостатична [26], цикл деления микробной клетки в среднем 20 минут. То есть каждые 20 мин численность микробов удваивается. По закону гомеостаза столько же микробов должно отмирать и выдавать свои фрагменты в окружающую среду – в том числе в кровь. Концентрация микробных маркеров в крови в 60 раз меньше, чем на кишечной стенке  как показано при прямом сопоставлении [27].

При идентификации составляющих микст-инфекции и определении их концентрации используют математический алгоритм анализа суперпозиций части липидных профилей (по данным состава липидных компонентов чистых культур микроорганизмов) с учетом их доли в микробной клетке, наложения вкладов от разных микроорганизмов и фона биологической жидкости. Основой расчетов служат формулы баланса жирных кислот и банк химического состава микроорганизмов, колонизирующих организм человека или являющихся возбудителями инфекционных заболеваний. Банк данных создается однократно при построении алгоритма исследования, не требует повторных референтных тестов при последующих анализах, но допускает введение дополнительных параметров при обнаружении новых микроорганизмов. Выбор групп селективных ионов, детектируемых при ГХ-МС — исследовании и временную последовательность измерений осуществляют таким образом, чтобы учесть определенные маркеры и избежать измерения интенсивных фоновых веществ.

Результаты

В синовиальной жидкости больных обнаружены разветвленные жирные кислоты, гидрокси-кислоты, специфические ненасыщенные и циклопропановые кислоты, жирные альдегиды, характерные для клеточных стенок и мембран микроорганизмов. На рис 1 показан участок масс-фрагментограммы синовиальной жидкости по иону 87, специфичному для большей части жирных кислот. На этом участке визуально можно видеть, что в синовиальной жидкости (по сравнению с кровью) выше концентрация маркера общей микробной нагрузки – пальмитолеиновой кислоты, маркеров клостридий, родококков, дрожжей кандида. Пик репера – маргариновой кислоты  – при этом одинаков.

Рис. 1. В синовиальной жидкости (верхняя хроматограмма) по сравнению в кровью (нижняя хроматограмма) выше концентрация маркера общей микробной нагрузки – пальмитолеиновой кислоты (пик 12.18), маркеров клостридий (пик 12.10), родококков (13.20), дрожжей кандида (13.50). Пик репера – маргариновой кислоты (13.80) – при этом одинаков.

Расчетные данные состава микробиоты биопленки сустава, реконструированные по концентрации микробных маркеров в синовиальной жидкости, приведены в усредненном виде на рис 2, где показано в численном и графическом виде изменение микробной колонизации сустава по сравнению с СЖ пациентов без признаков инфекции. Эти изменения носят регулярный характер избыточного роста бактерий (инфекции) более чем в 60% случаев, поэтому мы ограничиваемся рассмотрением усредненных данных, не перегружая объем изложения конкретными измерениями 62 маркеров в СЖ и крови 21 ребенка и расчетными данными реконструкции микробиоты.

Рис 2.  Усредненное микробное сообщество сустава при гонартрите, реконструированное по микробным маркерам в синовиальной жидкости. В качестве нормы приняты данные двух анализов, в которых концентрация всех маркеров микроорганизмов в отдельности и в сумме минимальна.

 

Общим признаком большей  части пациентов является более чем двукратное (до двух порядков в отдельных случаях) превышение концентраций маркеров кишечных анаэробов: клостридий группы Clostridium ramosum, лактобацилл, эубактерий (род Eubacterium) и пропионобактерий, а также актинобактерий Nocardia и дрожжей кандида. Менее выражено участие в инфекционном процессе других анаэробов: Actinomyces viscosus, Streptococcus mutans, C. perfringens, Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella. Несколько меньше  аэробов — стафилококков, стрептококков, энтерококков, руминококков. В смешанной инфекции принимают участие также грамотрицательные микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus, Klebsiella) и другие – у них общие маркеры в ранге семейства), бактерии родов Moraxella/Acinetobacter, Fusobacterium/Haemophylus, Helicobacter. Однако их численность на два порядка ниже, чем у доминирующей группы. Другие грамотрицательные бактерии, такие как представители родов  Stenotrophomonas, Neisseria, Bacteroides, Burkholderia, не превышали уровня клинической значимости или предела детектирования. Клинически значимый уровень превышают маркеры известных патогенов — Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes, Staphylococcus,  Enterococcus и другие (рис 2).

Параллельный с СЖ анализ крови детей из основной группы обследованных (N=14) на микробные маркеры показал во всех случаях, кроме одного, дефицит колонизации организма (что относится в основном к кишечной микробиоте) при регулярном избыточном росте маркеров Eubacterium lentum и в большинстве случаев группы Moraxella/Acinetobacter и энтерококков. Прямой корреляции изменения концентрации маркеров в крови с маркерами в СЖ не обнаружено. Состав и расчетная численность микроорганизмов индивидуальны для каждого обследованного и по-разному соотносятся в СЖ и крови одного и того же ребенка. Поэтому статистический анализ по этим параметрам не уместен. В некоторых случаях суммарная концентрация маркеров микроорганизмов в СЖ меньше, чем в крови, что не дает основания говорить об их источнике в области сустава. Однако при сравнении численности отдельных микроорганизмов можно видеть, что некоторых из них больше в СЖ по абсолютной величине; численность же других  неадекватно выше, чем в крови. На рис 3 приведен пример сопоставления относительного количества микроорганизмов (в процентах от суммы) рассчитанных по концентрации микробных маркеров в СЖ и крови. Сопоставление относительного содержания микроорганизмов в суставе и кишечнике (реконструкция по синовиальной жидкости и крови соответственно) показывает, что в суставе относительно больше клостридий (Clostridium ramosum), нокардий и стрептококков, дрожжей кандида, актинобактерий Streptomyces и цитомегаловируса – они являются главными агентами воспаления сустава (численность 106 – 108 клеток/мл). Минорную группу (численность 105 – 106 клеток/мл) составляют бактерии, которые обычно выявляют посевом на искусственные среды – Acinetobacter,  Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes, Staphylococcus и другие. Это означает, что в зоне синовиальной жидкости имеется источник маркеров этих бактерий, то есть сустав ими колонизован.

С другой стороны, в двух пробах  концентрация маркеров микроорганизмов оказалась на порядок ниже, чем в крови при  отсутствии ассиметрии маркеров.  Эти данные были приняты в качестве нормы.

Обсуждение

Как показывает предварительный анализ экспериментальных измерений – выявлять агент воспаления при синовитах следует по абсолютному превышению расчетной численности микроорганизмов в суставе (по маркерам в СЖ) по сравнению с фоном микроэкологического статуса (по маркерам в крови), но и по соответствующим относительным изменениям. Относительные изменения численности отдельных микроорганизмов в суставе – диспропорция в сравнении с их профилем в общем микроэкологическом статусе достигает сотен раз для стрептококков, десятки раз для клостридий и нокардий. В несколько раз выше, в СЖ по сравнению с кровью относительная концентрация маркеров бактерий родов Moraxella/Acinetobacter, Fusobacterium/Haemophylus и Clostridium perfringens. Такие изменения характерны для большинства обследованных пациентов. У некоторых детей при гонартритах наблюдается увеличение концентрации до десяти и более раз маркеров Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Eubacterium lentum, Campylobacter mucosalis, хеликобактера, превотелл, и дрожжей кандида (рис 3).

Рис 3.  Микробные маркеры в синовиальной жидкости и крови в %. Сопоставление относительного содержания микроорганизмов в суставе и кишечнике (реконструкция по синовиальной жидкости и крови соответственно) показывает, что в суставе относительно больше   клостридий (Clostridium ramosum), нокардий и стрептококков,  дрожжей  кандида, актинобактерий Streptomyces и цитомегаловируса – они являются главными агентами инфекции сустава (численность 106 – 108 клеток/мл). Минорную группу (численность 105 – 106 клеток/мл) составляют бактерии, которые обычно выявляют посевом на искусственные среды – Acinetobacter,  Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes, Staphylococcus и другие.

 

Случаев относительного увеличения численности бактерий сем. Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella и другие) и золотистого стафилококка не обнаружено. Кратность увеличения численности клостридий группы Clostridium ramosum составляет два-четыре раза. Это не много, по сравнению с другими потенциальными возбудителями инфекции сустава, но их абсолютная численность в среднем на порядок выше, чем стрептококков. Такой избыточный рост отдельных микроорганизмов чреват образованием вирулентных штаммов. По той же причине инфекционную угрозу могут представлять также эубактерии, лактобациллы, бифидобактерии и пропионобактерии, поскольку концентрация их маркеров в СЖ при повреждении в несколько раз превышает фоновую (рис 2).

Обсуждая пути инфицирования сустава при закрытой травме, в качестве эндогенного источника следует рассматривать, прежде всего, кишечный биоценоз. Полученные в результате исследования данные свидетельствуют о транслокации микроорганизмов в коленный сустав в результате его травмы. Именно микроорганизмов, а не только их клеточных компонентов, по которым ведется исследование синовиальной жидкости методом масс-спектрометрии микробных маркеров при воспалении. Об этом свидетельствует либо превышение концентрации в ней липидных мономеров — жирных кислот, альдегидов, стеринов — маркеров, специфичных для клеточных стенок микроорганизмов, по сравнению с кровью, либо диспропорция в сторону увеличения отдельных маркеров. И то, и другое свидетельствует о наличии источника этих веществ в зоне воспаления, а значит и самих микробов. Инфицирование внутренних органов за счет транслокации бактерий из кишечника или ротовой полости известно давно и признается большинством клиницистов. Считается, что транслокация кишечной микробиоты является основным механизмом эндогенного инфицирования [28]. Это означает, что и в нашем случае при синовите следует ожидать появление в зоне воспаления любых обитателей кишечника – к настоящему времени известно 1800 фенотипов на уровне рода по данным анализа 16S-рРНК [29,30].  А почему не всех сразу? Это вопрос чувствительности и информативности метода. Метод, примененный в настоящем исследовании, позволил сканировать одновременно 170 маркеров микроорганизмов разного таксономического уровня и их групп. Выявлено превышения уровня детектирования 47 из них, которые в разной комбинации и количественном выражении присутствуют у всех обследованных. Уровень смешанной инфекции и ее состав отражают специфику микробной этиологии синовита отдельных пациентов и дает дополнительную информацию для антибиотикотерапии и других лечебных действий по восстановлению микроэкологического статуса больного.

Подтверждение такой массовой транслокации можно найти в литературе. Еще в 1902 г (Askoli, 1902 цитируется по [28]) обсуждается понятие транслокации всех представителей условно-патогенной микробиоты кишечника в лимфоузлы, печень, селезенку и другие органы. Сейчас становится известным, что не только грамотрицательные микроорганизмы или их эндотоксины, но и грамположительные бактерии и грибы могут преодолевать кишечный барьер [31]. И это экспериментально подтверждено в одной из последних масштабных работ по анализу микробиоты суставов при сопоставлении данных культурального и генетического методов. Получено 475 изолятов бактерий (в том числе 176 из коленного сустава) культуральным методом, идентификация которых совпала с данными гомологии 16s рРНК. Показано, что колонизация носит полимикробный харатер [32]. Считается, что стимулом транслокации является избыточный рост кишечной микробиоты или стресс [28]. В нашем случае стрессом является травма сустава. В современной литературе есть данные по инфекции синовиальной жидкости отдельными микроорганизмами сем Enterobacteriaceae, гипотезы об участии анаэробов кишечника, связи артритов с их избыточным ростом [33,34].  Бактериальные изоляты были получены из синовиальной жидкости при септическом артрите. Выделены ампликоны ДНК различных микроорганизмов, а также их пептидогликан-полисахаридные комплекы [35]. В том числе выделены культуры анаэробов [36]. Причем, как показано в работе I.Brook анаэробы доминируют среди изолятов  [37]. От 77 больных из суставов выделено 122 изолята анаэробов при 35 аэробах и факультативных анаэробах. Среди них бактероиды, анаэробные кокки, фузобактерии и клостридии в порядке частоты обнаружения. В настоящей работе в синовиальной жидкости обнаружены маркеры почти всех кишечных микробов, определяемых по маркерам в крови. Почему они приходят в сустав при воспалении? Причем приблизительно в том списочном составе, в котором они работают в кишечной биопленке. Может, для того, чтобы в очаге воспаления создать сбалансированную лечебную биопленку и тем самым препятствовать одностороннему развитию бактерий в состоянии экспрессии факторов патогенности? Действительно, эксперименты с безмикробными и конвенциальными крысами позволяют сделать такое предположение [29,38]. Отмечается также, что микробная популяция полости рта выполняет двоякое значение: с одной стороны – роль биологического барьера, с другой потенциального резервуара аутоинфекции [39,40]. Тогда  роль агентов воспаления можно приписать тем микроорганизмам, которые проявляют диспропорциональный кишечнику рост в его очаге – суставе.

Заключение

Анализ полученных данных при исследовании синовиальной жидкости и венозной крови детей с различными симптомами проявления посттравматического артрита коленного сустава при помощи метода газовой хроматографии – масс – спектрометрии в режиме масс-фрагментографии, показал наличие транслокации микроорганизмов в коленный сустав в результате его травмы.  При этом все кишечные микробы приходят в сустав при воспалении приблизительно в той пропорции, в которой они пребывают в кишечной биопленке, которая является основным источником эндогенной микрофлоры и теоретически любой ее микроорганизм может участвовать в реакции воспаления. Предполагается, что это происходит с целью создания в месте воспаления сбалансированной лечебной биопленки, тем самым препятствуя одностороннему  развитию бактерий в состоянии экспрессии факторов патогенности. С другой стороны, относительные изменения численности отдельных микроорганизмов в суставе – диспропорция в сравнении с их профилем в общем микроэкологическом статусе (кишечнике, маркеры в крови) достигает десятков и сотен раз, что позволяет предполагать их в качестве потенциальных агентов воспаления.

Нарушение локальной микроциркуляции в коленном суставе со снижением его способности к самоочищению, выявленное нами наличие маркеров возбудителей инфекционных процессов в 1-е дни после травмы коленного сустава, позволяют говорить о развитии субклинического бактериального процесса в нем. Наличие травмы, результат гистологических исследований с выявлением признаков синовиальной реакции и выявленное в ходе представленного исследования увеличение концентрации бактериальных маркеров в пунктате коленного сустава, позволяет нам утверждать, что инфицирование коленного сустава, (попадание в него микроорганизмов) происходит в первые часы и дни после травмы, т.е. можно говорить о потенциальном воспалении – артрите, что требует комплексного подхода к диагностике и лечению данной патологии у детей.

 

Список литературы:

  1. Богатов В.Б. Артроскопическая диагностика и лечение внутрисуставных повреждений коленного сустава у детей: Автореф. дис. … канд. мед. наук / В.Б. Богатов. Самара, 2002. с 22;
  2. Дорохин А.И. Комплексное лечение переломов костей у детей, осложненных нарушением консолидации. Дисс… док. мед. наук. / А.И. Дорохин. М., 2005. с 381;
  3. Меркулов В.Н., Карам Е.А., Соколов О.Г., Ельцин А.Г. // Артроскопическая диагностика и лечение повреждений хряща коленного сустава у детей. // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Пирогова. 2003. № 2. с 74-79;
  4. Тимофеев И.В., Рассовский С.В. Роль артроскопии в диагностике острого травматического вывиха надколенника у детей. // Детская хирургия. № 3. 2006. с 12-14;
  5. Тимофеев И.В. Клиника, диагностика и эндоскопические методы лечения острого вывиха надколенника у детей. Автореф. Дис… канд. мед. наук. М., 2004. с 18;
  6. Ушакова С.А. Роль артроскопии в диагностике и лечении повреждений и заболеваний суставов. // Ортопедия, травматология и протезирование. № 10. с 74-78;
  7. Dandy D.J. Artroscopy in the treatment of young patients with anterior knee pain. \\ Ortop. Clin. North America. 1986. № 17. p. 221-229;
  8. Kao S.C., Smith W.L. Skeletal injuries in the pediatric patient. \\ Radiol. Clin. NorthAm. 1997/ № 35. p. 727-746;
  9. Крестьяшин В.М. Повреждения и заболевания коленного сустава у детей. (Клиника, диагностика, лечение). Дисс… док. мед. наук. М., 1999. с 350;
  10. Анселл Б.М. Ревматические болезни у детей, пер. с англ., с. 80, М., 1983;
  11. Клиническая ревматология, под ред. X. Каррея, пер. с англ., М., 1990;
  12. Клиническая рентгенорадиология, под ред. Г.А. Зедгенидзе, т. 3, М., 1983;
  13. Насонова В.А. и Астапенко М.Г. Клиническая ревматология, М., 1989;
  14. Рейнберг С.А. Рентгенодиагностика заболеваний костей и суставов, т. 2, М., 1964. с. 535;
  15. Руководство по детской артрологии, под ред. М.Я. Студеникина и А.А. Яковлевой, Л., 1987;
  16. Выборнов Д.Ю. Нерентгеноконтрастные внутрисуставные переломы у детей // Актуальные вопросы детской хирургии, ортопедии, травматологии, анастезиологии и реанимации. 1994. 167-168;
  17. Song HG, Lee HC, Joo YH, et al. Clinical and microbiological characteristics of spontaneous bacterial peritonitis (SPB) in a resent five year period. Taehan Kan Hakhoe Chi 2002; 8: 61-67;
  18. Viera SM, Silveira TR, Matte U, et al. Amplification of bacterial DNA does not disringuish patients with ascitic fluid infection from those colonized by bacteria. JPediatr Gastroenterol Nutr. 2007; 44(5): 603-607;
  19. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином. Вестник РАМН.-1999; 16(7): 25-31;
  20. Митрука Б. М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. М..Медицина 1978;
  21. Осипов Г.А, Федосова Н.Ф., Лядов К.В. Количественный in situ микробиологический анализ по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода газовой хроматографии – масс спектрометрии. Здравоохранение и медицинские технологии № 5 2007 стр. 20-23;
  22. Бойко Н.Б., Осипов Г.А., Белобородова Н.В., КурчавовВ.А. Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и перитонеальном экссудате брюшной полости при гангренозно-перфоративном аппендиците. Инфекции в хирургии. Том 7, №2, с. 58, 2009;
  23. Хабиб  О.Н. Белобородова Н.В. Осипов Г.А. Детектирование молекулярных маркеров бактерий в ткани клапанов сердца в норме и при патологии с применением метода газовой хроматографии и масс-спектрометрии Журн. Микроб. Эпидем. Иммун., 2004, Том 7, № 3: 62-68;
  24. Винницкая Е.В. Спонтанный бактериальный перитонит у больных циррозом печени. Дисс. Докт. Мед. Наук, Москва 2009;
  25. Винницкая Е.В., Осипов Г.А., Дроздов В.Н., Петраков А.В., Лазебник Л.Б. Диагностика спонтанного бактериального перитонита при циррозе печени. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. №3. 2008. стр. 18-24;
  26. Beloborodova N.V., Osipov G.A. 2000. Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship. Microb.Ecol.Heal.Dis., SCUP, 12: 12-21;
  27. Осипов Г.А. Определение состава и количества микроорганизмов кишечной стенки методом хромато-масс-спектрометрии по клеточным жирным кислотам.  В кн. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых», КМК Scientific Press, Москва 2003, с. 89-98;
  28. Бокерия Л.А. Белобородова Н.В. Инфекция в кардиохирургии. М.: НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2007, 582 стр.;
  29. Hattori M., Taylor T. D. The Human Intestinal Microbiome: A New Frontier of Human Biology DNA RESEARCH 16, 1–12, (2009);
  30. Paliy O., Kenche H., Abernathy F., Michail S. High-Throughput Quantitative Analysis of the Human Intestinal Microbiota with a Phylogenetic Microarray. Appl. Environ. Microbiol., June 2009; 75(11): 3572-9;
  31. MacFie J.Current status of bacterial translocation as a cause of surgical sepsis. British Medical Bulletin, 2004; 71: 1–11;
  32. Fenollar F., Roux V., Stein A., Drancourt M., Raoult D. Analysis of 525 samples to determine the usefulness of PCR amplification and sequencing of the 16S rRNA gene for diagnosis of bone and joint infections. J. Clin. Microbiol., 2006, Vol. 44, № 3, p. 1018-1028;
  33. Hazenberg MP, Klasen IS, Kool J, Ruseler-van Embden JG, and Severijnen Are intestinal bacteria involved in the etiology of rheumatoid arthritis? Review article. APMIS, January 1, 1992; 100(1): 1-9;
  34. Vaahtovuo J., Munukka E., Korkeamaki M., Luukainen R., Toivanen P. Fecal Microbiota in Early Rheumatoid Arthritis. J Rheumatol, Aug 2008; 35: 1500 – 1505;
  35. van der Heijden IM, Wilbrink B, Tchetverikov I, Schrijver IA, Schouls LM, Hazenberg MP, Breedveld FC, and Tak PP. Presence of bacterial DNA and bacterial peptidoglycans in joints of patients with rheumatoid arthritis and other arthritides. Arthritis Rheum, March 1, 2000; 43(3): 593-8;
  36. Clarke HJ and Allum R.  Anaerobic septic arthritis due to bacteroides: brief report. J Bone Joint Surg Br, Nov 1988; 70-B: 847 – 848;
  37. Brook I and Frazier EH. Anaerobic osteomyelitis and arthritis in a military hospital: a 10-year experience. Am J Med, January 1, 1993; 94(1): 21-8;
  38. van den Broek MF, van Bruggen MC, Koopman JP, Hazenberg MP, and van den Berg WB. Gut flora induces and maintains resistance against streptococcal cell wall-induced arthritis in F344 rats. Clin Exp Immunol, May 1, 1992; 88(2): 313-7;
  39. Тец В.В., Орехова Л.Ю., Доморад А.В., Яковлева О.М., Щербакова Д.С., Румянцева O.K., Левкович Д.В., Томсон Н.В.. Распространение  возбудителей соматических заболеваний в нормальной микрофлоре ротовой полости //Пародонтология- -№4.- С. 9-12;
  40. Хуснутдинова, Л.М. Микрофлора слизистой оболочки миндалин человека в норме при патологии / Л.М.Хуснутдинова // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.. – 2006. – №1. – С.60-63.

Комментировать