Исследование состава микробиоты носоглотки детей с хроническим аденоидитом с использованием метода масс-спектрометрии по микробным маркерам

Выводы.

  1. Бессимптомные кисты верхнечелюстных пазух обнаружены у 20,9% практически здоровыхлюдей.
  2. Чаще всего кисты исходили из нижней стенки верхнечелюстной пазухи (в 78,4%случаев).
  3. Отсутствие клинических проявлений кисты объясняетсяее малыми размерами, не приводящи- ми к обструкции естественного соустья пазухи.
  4. Список литературы
  1. Кисты лобных пазух / А.Г. Волков и соавт. // Россий-

Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol Endod. — 2011. — Vol. 112, N 6. — P. 97—102.

  1. Mucosal cysts of the maxillary sinus: a literature review/
  2.  Veltrini et al. // Med. Oral. — 2001. — Vol.  6, N 3. —      P.180—188.
  3. Mucus retention cyst of the maxillary sinus: the endo- scopic approach / Hadar et al. // Br. J. Oral Maxillofac. Surg. — 2000. — Vol. 38, N 3. — P.227—229.
  4. The incidence of maxillary sinus retention cysts in orth- odontic patients / J.A. Bósio et al. // World J. Orthod. — 2009. — 10, N 2. — P.7—8.

e-mail: nvboiko@gmail.com

 

ская ринология. — 2013. — № 3. — С. 24—28.  

  1. ПискуновИ.С. Компьютерная томография в диагностике заболеваний полости носа и околоносовых пазух.

— Курск, 2002. — 191 с.

  1. СеменовФ.В., Горбоносов И.В., Вартанян М.С. Симп- томатология кист верхнечелюстной пазухи // Вестн. ото- ринолар. — 2012. — № 1. — С. 8—10.
  2. Bhattacharyya N. Do maxillary sinus retention cysts reflect obstructive sinus phenomena? // Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. — 2000. — 126, N 11. — P. 1369— 1371.
  3. Characteristics and risk factors of mucosal cysts in the paranasal sinuses / I.J. Moon et al. // — 2011. — Vol. 49, N 3. — P.309—314.
  4. Clinical features of patients with paranasal sinus cysts/
  5. Tsuzukiet al. // Nihon Jibiinkoka Gakkai Kaiho. — 2009. — Vol. 112, N 12. — P. 801-808.
  6. Harar P., Chadha N.K., Rogers G. Are maxillary mu- cosalcysts a manifestation of inflammatory sinus disease? // J Laryngol. Otol. — 2007. — Vol. 121, N 8. — P. 751—754.
  7. Maxillary mucosal cyst is not a manifestation of rhinosi- nusitis: results of a prospective three-dimensional CT study of ophthalmic patients / J. Kanagalingam et al. // Laryngo- scope. — 2009. — 119, N 1. — P.8—12.
  8. Maxillary sinus floor augmentation in patients withmaxil- lary sinus pseudocyst: case report /  Celebi et al. // Oral

Resume

N.V. Boiko, S.Yu. Toporkova

RATE OF ASYMPTOMATIC CYSTS IN MAXILLARY SINUSES

Keywords: maxillary sinus, cysts, CT.

 

The aim of this research was to study the rate of detection of maxillary sinus cysts in healthy people with the application of computed tomography scan- ning (CT). 177 healthy people (159 males and 18 females) between 19 and 35 were examined by the computed tomography technique. CT revealed as- ymptomatic cysts in the maxillary sinuses of 37 ex- amined people (20.9%). None of those examined showed any symptoms of the presence of obstruction of the sinus ostium.

УДК 616.323-007.66-056.2:576.8.073.3 Пост. 14.11.2013

И.В. Андриянова, С.Г. Вахрушев, И.А. Каширцева, О.Э. Казакова

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА МИКРОБИОТЫ НОСОГЛОТКИ ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ АДЕНОИДИТОМ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ПО МИКРОБНЫМ МАРКЕРАМ

КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. ПРОФ. В.Ф. ВОЙНО-ЯСЕНЕЦКОГО. КАФЕДРА ЛОР-БОЛЕЗНЕЙ С КУРСОМ ПО

 

 

Ключевые слова: хронический аденоидит, бак- териологическое исследование, газовая хромато- графия, масс-спектрометрия, биопленка.

Последнее десятилетие ознаменовалось фор- мированием новых представлений о развитии хро- нического процесса воспаления, в том числе и на слизистой оболочке носоглотки. Основные откры- тия в этой области связаны с изучением бактери- альных биопленок. Накопившиеся данные свиде- тельствуют о новых свойствах бактерий, находя- щихся в составе сообществ, наиболее актуальным из которых для практической медицины является повышенная выживаемость микроорганизмов в биопленках [8, 11, 12, 13, 14, 16].

Целью работы явилось изучение видового и количественного состава микрофлоры слизистой оболочки носоглотки методом детектирования ми-

кроорганизмов по химическим маркерам в сравне- нии с бактериологическим исследованием у детей с диагнозом «хронический аденоидит».

Пациенты и методы. Работа основана на ре- зультатах обследования 68 пациентов, проходив- ших плановое хирургическое лечение в ЛОР-отде- лении ККБ г. Красноярска в 2010—2013 гг. Возраст пациентов колебался от 3 до 12 лет, средний воз- раст составил 5,3 ± 2,8 года. Среди детей мальчи- ков было 34 (50%), девочек — 34 (50%). Основным критерием включения в исследование явилось на- личие у пациентов клинических проявлений хрони- ческого аденоидита с показаниями для хирургиче- ского лечения.

Аденотомию выполняли под эндотрахиальным наркозом. Перед удалением под контролем эндо- скопа стерильным тампоном проводили сбор мате- риала с поверхности глоточной миндалины, используя коммерческие транспортные среды со средой Эймса (производство БиоМерье, Франция). Посев проводили методом секторов на дифференциаль- но-диагностические среды (кровяной агар, жел- точно-солевой агар, среда Эндо, энтерококкагар), учитывали количество колоний и выделяли чистые культуры микроорганизмов с их идентификацией. Одновременно отобранный на стерильные зонды биологический материал подвергали серии хими- ческих модификаций, в результате которых анали- зировали лишь метиловые эфиры жирных кислот, спирты и альдегиды, проводя идентификацию ми- кроорганизмов по специфическим жирным кисло- там методом газовой хроматографии и масс-спек- трометрии [4—7, 15].

Для клинической диагностики микроорганиз- мов в составе биопленки используются различные молекулярные методы, в том числе газовая хро- матография и ее сочетание с масс-спектрометри- ей. Детектирование микроорганизмов в составе биопленки проводится по составу специфичных жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов, определяемых в мазке, взятом с поверхности уда- ленной глоточной миндалины. В основе метода лежит высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов [3].

Этот метод микробиологического исследования быстр и универсален, поскольку не требует выра- щивания отдельных микроорганизмов на специ- альных средах и проведения для каждого из них специальных биохимических тестов для определе- ния вида возбудителя [2]. Точное количественное определение микроорганизмов способствует на- значению целенаправленной антибактериальной терапии и оперативному контролю ее эффективно- сти. Метод зарегистрирован Росздравнадзором в качестве новой медицинской технологии (Разреше- ние ФС №2010/038 от 24 февраля 2010 г.). Метод масс-спектрометрии позволяет получить инфор- мацию о «замаскированной» части микст-инфек- ции, состоящей из некультивируемых в условиях

*— различия между сравниваемыми показателями во всех группах статистически достоверны р < 0,05.


Рис. 1. Видовое распределение микрофлоры, полученной с поверхности глоточной миндалины у детей 3—12 лет по результатам микробиологического исследования.

лабораторий клинической микробиологии микроор- ганизмов. По сравнению с традиционными мето- дами бактериологического исследования исполь- зование хемодифференциации с помощью хро- мато-масс-спектрометрии позволяет значительно сократить время исследования до 2,5 ч и снизить его стоимость, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, кото- рые особенно сложны и трудоемки для анаэробов.

Известно, что в процессе метаболизма микроб- ные клетки производят низшие карбоновые кисло- ты, набор которых является видоспецифическим [2, 3, 10]. Метод детектирования микроорганизмов по жирным кислотам-маркерам сходен с генетическим анализом (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов 16sРНК). Однако высокочувствитель- ный и селективный метод газовой хроматогра-  фии — масс спектрометрии позволяет одновремен- но измерять концентрации более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом мате- риале: крови, моче, биоптатах и других биологиче- ских жидкостях и тканях без использования тесто- вых биохимических материалов.

Отделяемое с поверхности глоточной миндали- ны в количестве 0,04 г подвергали кислому гидро- лизу в 0,4 мл 1 М HCl на метаноле в течение 1 ч при температуре 80 °С. В результате реакции метано- лиза жирные кислоты, входящие в состав сложных липидов пробы, освобождались в виде метиловых эфиров, которых двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали 20 мкл N, О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в тече- ние 15 мин при температуре 80 °С, для получе- ния триметилсилильных эфиров гидроксикислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжек- тор хромато-масс-спектрометрической системы HP-5973 Hewlett-Packard (США).  Для  управления и обработки данных использовали штатные про- граммы прибора. Хроматографическое разделе- ние пробы осуществляли на капиллярной колонке 0,25 нм ´ 25 м с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Hewlett-Packard. Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автома- тически по заданной программе. Полученные дан- ные были введены в программу расчета, подготов- ленную в электронных таблицах Excel.

Метод характеризуется следующими показате- лями: определение более 50 микроорганизмов од- новременно в одном анализе при универсальности в отношении разных групп микроорганизмов — бак- терий, грибов, вирусов. Время анализа составляет 2,5 ч, чувствительность — 103 – 104 клеток в пробе, селективность — до вида.

Измеренные концентрации микробных жирных кислот подставляют блоком в шаблон электронной таблицы EXCEL, в которой автоматически проис- ходит реконструкция количественного состава микст-инфекции в виде стандартной таблицы ре- зультатов, где полученные  данные  сопоставлены с нормой в табличной и графической формах. На основании выработанного ранее статистического критерия [1,10], отклонения от нормы приобретают клиническую значимость, когда численность ми- кроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой.

Результаты исследования. По результатам микробиологического исследования на поверхно- сти глоточной миндалины были идентифицирова- ны: S. Aureus (20% от общего отчета микробиоты),

  1. haemoliticus(18%), S. Epidermidis (15%). Такжеприсутствовали  в  меньших  количествах  E.  coli,
  1.  faecium,  P.   aeruginosa,  E.  faecalis,  P.morganii,
  2. mirabilis,S. saprophyticus, N. Subflava (рис. 1). При этом в 30% роста флоры не выявлено, в 36% случа- ев получена монокультура и в 34% — ассоциации микроорганизмов.

В то же время, данные хромато-масс-спек- трометрического исследования выявили присут- ствие в очаге воспаления и других микроорга- низмов (рис. 2), в том числе Clostridium ramosum, Fusobacterium/Haemophylus, Sp. Enterobacteriaceae (E. coli и др), Eubacterium moniliforme, Nocardia as- teroides, Butyrivibrio/Cl. Fimetarum, Propionibacterium jensenii, Afipia sp., Helicobacter mustelae, Actinomy- cetes 10Me14, микроскопические грибов и вирусов (Herpes sp.).

Из полученных результатов следует, что наря- ду с культивируемой флорой метод масс-спектро- метрии микробных маркеров позволяет выявить дополнительные изменения микроэкологического статуса слизистой оболочки носоглотки. Наши ис- следования показали, что у детей с хроническим аденоидитом определяется избыточная концен- трация маркеров Enterobacteriaceae и Clostridium ramosum c периодическим подключением много- численных представителей рода Eubacterium. Более чем втрое по сравнению с нормой растет концентрация маркеров Clostridium ramosum и Clostridium propionicum, почти у всех больных воз- растает количество E. lentum.

Из данных результатов газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией следует, что изме- рение микробных маркеров in situ выявляет новую группу микроорганизмов из числа трудно культиви- руемых и поэтому мало известных в клинической практике. Эти участники инфекционного  процес- са — Clostridium, Eubacterium, Enterobacteriaceae, Lactobacillus, Helicobacter — обладают высокой па-

тогенетической активностью, и вызванные ей забо- левания трудно поддаются лечению [9,15].

Выводы.

  1. Данные микробиологического исследования в сравнении с хромато-масс-спектрометрией показа- ли,что определение 60—80% микробиоценоза сли- зистой оболочки носоглотки недоступно для культу- ральных методов исследования.
  2. Данные хромато-масс-спектрометрии c поверх- ности удаленной глоточной миндалины показыва- ют, что наряду со стрептококками и стафилоккока- ми определяются маркеры энтеробактерий, эубак- терий, клостридий и различных видовгрибов.
  3. Несомненным достоинством метода хрома- то-масс-спектрометрии являются информатив- ность, чувствительность, определение трудно- культивируемых микроорганизмов, возможность расширять перечень определяемых химических маркеров.

Таким образом, использование в клинической практике результатов хромато-масс-спектрометрии может способствовать строго индивидуальному подбору оптимального метода лечения у больных хроническим аденоидитом.

Список литературы

  1. Белобородова,Н.В. Госпитальные инфекции у детей, вызванные «проблемными» грамположительными кок- ками: новые возможности антибиотикотерапии / Н.В. Бе- лобородова, Д.А. Попов, Т.Ю. Вострикова // Педиатрия.

— 2007. — Т. 86, № 5. — С. 43—50.

  1. Осипов Г.А., Бойко Н.Б. Новые подходы к анализу ин- фекционных послеоперационных и посттравматических осложнений// Педиатрия. —  — Т. I, № 1. — С. 61—65.
  2. Осипов, Г.А. Хромато-масс-спектрометрический ана- лиз микроорганизмов и их сообществ в клинических про- бахпри инфекциях и дисбиозах / Химический анализ в ме- дицинской диагностике — М.: Наука,  — С. 293—368.

Рис. 2. Видовое распределение микрофлоры, полученной с поверхности глоточной миндалины, по результатам хромато-масс-спектрического исследования.

*— различия между сравниваемыми показателями во всех группах статистически достоверны р < 0,05.

  1.   Пат. РФ № 2086642. МПК7 С 12N 1/00, 1/20, C12Q 1/4.

Способ определения родового (видового) состава ассо- циации микроорганизмов /Осипов Г.А.; заявл. 24.12.1993. 5.    Пат.      РФ     №     2146368,     РФ     МПК7     G01N33/48,

G01N33/52 Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорга- низма / Осипов Г.А., Белобородова Н.В. заявл. 21.10.1997.

  1. Пат. №2021608 РФ, МПК7 G01N 33/50 Способ диаг- ностики анаэробной газовой инфекции / Осипов Г.А., Истратов В.Г., Шабанова Е.А. и др.; заявл. 27.05.1991; опубл. 15.10.1994, Бюл. №
  2. СтруковаЕ.Г., Ефремов А.А., Гонтова А.А. и др. Опре- деление микробиологического статуса и диагностика ин- фекций организма человека с использованием метода хромато-масс-спектрометрии // Журн. СФУ. — Химия — Т. 2, Вып. 4. — 2009. — С. 351—358.
  3. Тец В.В. Микроорганизмы и антибиотики. Инфекции в оториноларинго-логии. — СПб.: КЛЕ-Т, 2009 — 168с.
  4. ХоултДж., Криг Н., Снит П. и др. Определитель бакте- рий Берджи. В 2-х т. — М.: Мир, 1997. — Т.
  5. Beloborodova V., Osipov G.A. 2000. Small molecules originatingfrom microbes (SMOM) and their role in microbes- host relationship. Microb.Ecol.Heal.Dis., SCUP, 12: 12—21.
  6. Bradshaw D.J., Marsh D., Watson G.K. et al. Role of Fusobacterium nucleatum and coaggregation in anaerobe survival in planktonic and biofilm oral microbial communities during aeration  //  Infect.  Immun.  —  1998.  —  V.  66.  — P.4729—4732.
  7. Costerton J.W., Stewart S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections  // Science. — 1999. — Vol. 284. — P.1318—1322.
  8. Katherine Lemon, Vanja Klepac-Ceraj,Hilary
  9. Schiffer, et al. Comparative Analyses of the Bacterial Microbiota of the Human Nostril and Oropharynx. mBio 1(3): e00129-10. doi:10.1128/mBio.00129-10. 2010.
  10. Kolenbrander E., Andersen  R.N.,  Kazmerzak  K.M. et al. Coaggregation coadhesion in oral biofilms // Com- munity structure and Co-operation in biofilms. Society for General  Microbiology  Symposia  /  D.G.  Allison,  P.Gilbert,
  11. Lappin-Scott, M. Wilson. — Cambridge UniversityPress,
  12. — N 59. — P. 65—85. [http://dx.doi.org/10.1017/CBO9780511754814.006]
  13. Sonesson A., Larsson L., Westerdahl G. et al. Determi- nation of endotoxins by gas chromatography: evaluation of electron-capture and negative-ion chemical ionization mass spectrometric detection of halogenated derivatives of beta- hydroxymyristic acid // J. Chromatogr. — 1987 — 417,

№1 — P. 11—25.

  1. Watnick, Kolter R. Biofilm, City of Microbes // J. Bacte- riol. — 2000 — Vol. 182, N 10. — P. 2675—2679.

e-mail: irina-doc@mail.ru

Resume

I.V. Andriyanova, S.G. Vakhrushev,

I.A. Kashirtseva, O.E. Kazakova

RESEARCH OF CHILDREN’S NASOPHARYNX CHRONIC ADENOIDITIS MICROBIOTA COMPOSITION WITH THE USE OF METHOD MASS SPECTROMETRIC BY MICROBIAL MARKERS

Keywords: chronic adenoiditis, bacteriological test- ing, gas chromatography, mass spectrometry, biofilm

The results showed that the determination of 60— 80% microbiota nasopharyngeal mucosa is not available for culture methods. With this, data of gas chromatogra- phy in combination with mass spectrometry identified on the surface of the gullet tonsil the markers of enterobac- teria, eubacteria, clostridia and various fungal species

В.П. Быкова1, Г.Ф. Иванченко1, Т.В. Короткова2

ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ХРОНИЧЕСКИХ ФАРИНГИТОВ

1 ФГБУ «НАУЧНО-КЛИНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИИ ФМБА РОССИИ»

2 ЗАО «МЕДИЦИНСКИЕ УСЛУГИ» ДЕТСКИЙ ЦЕНТР ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИМ. СЕМАШКО

Ключевые слова: хронический гипертрофиче- ский фарингит, лимфоидные гранулы задней стенки глотки, боковые валики, иммуногистохимия, Толл- подобные рецепторы.

Хронический гипертрофический фарингит зани- мает одно из ведущих мест в структуре ЛОР-патоло- гии и характеризуется длительным и упорным тече- нием, значительно влияющим на качество жизни пациентов, что определяет актуальность изучения пато- и морфогенеза данного заболевания для раз- работки патогенетически оправданной терапии. По современным представлеиям, появление лимфоид- ных гранул на задней стенке глотки трактуется как компенсаторная гиперплазия местной лимфоидной ткани после адено-тонзиллэктомии или рассматри- вается как компенсаторно-приспособительная ре- акции при вторичном иммунодефиците лимфоэпи- телиальных органов глотки в уловиях дисбиоза [1, 2, 3]. Развитие гипертрофического фарингита в детском возрасте зачастую оказывается составной ча- стью лимфопролиферативного синдрома, при этом особая роль отводится герпес-вирусной инфекции и острым респираторным заболеваниям верхних дыхательных путей [4, 5]. Гипертрофический фа- рингит взрослых остается менее изученным, хотя не исключено, что он попадает в сферу действия тех же факторов, что и в детском возрасте, и что на него распространяются те же этиопатогенетические представления. Сочетанность воспалительных и иммунологических (лимфоидная гиперплазия) ре- акций при гипертрофическом фарингите может найти объяснение в современной иммунологиче- ской концепции о единстве и взаимодействии ме- ханизмов и структур врожденного и адаптивного иммунитета [8]. Цель исследования — морфофунк- циональная оценка лимфоидных гранул на основе иммуногистохимического фенотипирования их кле- точных структур и выявления рецепторов врожден- ного иммунитета.

Комментировать