Кишечная микробиота как источник новых биомаркеров старения

Авторы: Безродный С.А., Шендеров Б.А.
ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского»

Введение

В 2013 году в Российской Федерации 32 млн человек имели возраст старше 60 лет; у 72% из них были выявлены те или иные хронические заболеваниями и более 17 млн человек находились на постоянном диспансерном наблюдении. Через 10 лет число таких граждан достигнет 40 млн человек. В отечественной экономике занято около 10 млн лиц пенсионного возраста; еще более 300 тыс. пенсионеров готовы продолжить свою рабочую деятельность. Для этого почти 15% граждан предпенсионного и пенсионного возраста желают пройти дополнительное обучение или повысить квалификацию, получив новые знания и трудовые профессии. В этой связи становится понятным, почему в последние годы в России и в других развитых странах мира растет интерес к выяснению причин старения и каким образом сохранять и улучшать физические и умственные способности пожилых людей. Накопленные данные свидетельствуют, что у лиц с повышением возраста даже при отсутствии заболеваний возникают и постепенно прогрессируют различные физические, метаболические, нервно-психические, клеточные и молекулярные нарушения практически во всех органах и тканях. В настоящее время полагают, что биомаркерами старения могут быть нестабильность геномной и митохондриальной ДНК, нарушение эпигеномной программы развития, окислительный стресс, хроническое воспаление, укорочение теломер, дисбаланс гомеостаза белков, ускоренное старение клеток, дисфункции митохондрий, дефекты трофических и энергетических сигнальных путей, истощение стволовых клеток, изменение внутриклеточной и межклеточной коммуникации. В течение многих лет доминировало мнение, что здоровье, долголетие и риск заболеваний, преимущественно обусловлены дефектами, возникающими в эукариотических клетках человека. Между тем, в последнее десятилетие возникла и получила все больше подтверждение новая парадигма, предлагающая рассматривать человека, как «суперорганизм», симбиотическое сообщество представителей Eukarya, Bacteriacea, Archaea и Viruses. С этих позиций, симбиотическую микробиоту высших животных организмов рассматривают, как важнейший экстракорпоральный орган этого суперорганизма, как эндогенный эпигеномный фактор, активно участвующий в регуляции роста и развития хозяина, его здоровья и заболеваний. Использование классических бактериологических и современных молекулярных «ОМИК»-технологий позволило детально исследовать структуру и многочисленные функции симбиотической микробиоты человека на протяжении всей его жизни, с рождения до глубокой старости. При этом оказалось, что микробиота каждого индивидуума имеет уникальный профиль, как по своей структуре, так и функциональной активности. У взрослых здоровых людей 80% кишечной микробиоты принадлежит трем доминирующим (более 109 кое/г) филам: Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria, среди которых преобладают определенные виды клостридий (C.leptum, C.coccoides) и представители родов Bacteroidetes, Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Propionibacterium; среди субдоминирующих (менее 109 кое/г) кишечных микроорганизмов наиболее часто обнаруживаются представители Lactobacillus, Proteobacteria, Fusobacterium, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, Desulfovibrio, Sporomusa, Apopobium, Methanobrevibacter и ClostridiumIV, XI, XIVb, XVIII групп. Попытки использовать микроэкологический профиль пищеварительного тракта в качестве нового биомаркера старения и долголетия в последние годы предпринимались неоднократно. Биоматериалом для таких исследований обычно служили фекалии людей, которые подвергались традиционному микробиологическому анализу и/или молекулярно-генетическому изучению [16–20; 26–33]. К сожалению, опубликованные к настоящему времени данные, касающиеся сравнительного состава микробиоты у лиц различного возраста, достаточно противоречивы. Это дало основание утверждать, что наши знания роли кишечного микробиома человека, как эндогенного фактора ускоренного старения, метаболических заболеваний или долголетия, пока еще весьма ограничены. Отсутствие единого мнения, какие изменения в кишечной микробиоте человека могут быть объективными биомаркерами старения, обусловлено чрезвычайно сложным и в то же время индивидуальным популяционным составом этой микробиоты. Кроме того, на результаты исследований существенное влияние оказывал разноречивый по возрасту состав обследованных групп, отсутствие коммерческих стандартных тест-систем, позволяющих объективно сравнивать структуру их кишечной микробиоты. Присутствие хронических заболеваний, использование для их лечения множества лекарственных средств, особенности пищевого рациона, малоподвижный образ жизни, другие физиологические и социально-психические особенности также являлись факторами, затрудняющими сравнительную оценку микроэкологического статуса у представителей этой категории населения. Хотя причинная связь возрастной сукцессии кишечной микробиоты со старением и/или долголетием человека, до настоящего времени окончательно не установлена, микроэкологические подходы к ее пониманию могут послужить отправной точкой для разработки новых и совершенствования имеющихся программ сохранения активного долголетия и восстановительной медицины. Является доказанным, что кровь человека несет широкий спектр биомолекул, включая нутриенты, гормоны, метаболиты и другие низкомолекулярные соединения, являющиеся структурными компонентами или секретируемые различными клетками суперорганизма. Более 40% всех этих соединений, обнаруживаемых в крови, имеют микробное происхождение. Липидный состав микроорганизмов достаточно специфичен для таксонов различного уровня (семейств, родов и даже видов). Знания структуры и количественного состава высших жирных кислот, алкоголей, стеринов и других липидных соединений в клеточной стенке определенных микроорганизмов позволяет использовать метод газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХМС) не только для определения указанных маркерных веществ в исследуемом биоматериале, но и устанавливать таксономическую принадлежность микроорганизмов, присутствующих в биосубстрате, взятом для изучения. ГХМС анализ, использованный нами в данной работе, основан на прямом извлечении липидных соединений из цельной крови, их разделении на газовом хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и последующей идентификации по площадям пиков и времени их выхода на масс-спектрометре. Предлагаемый метод обеспечивает возможность детектирования одновременно порядка 60 микроорганизмов при проведении анализа одного образца. Нами впервые предпринята попытка оценить профиль пристеночной микробиоты кишечника у лиц пожилого и преклонного возраста путем ГХМС анализа крови на содержание в ней 126 высших жирных кислот, гидрокси-кислот, спиртов, альдегидов и стеринов, специфических для различных таксономических групп микроорганизмов.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись 41 человек зрелого/пожилого – 45–59 лет (17 чел) и преклонного – 75–90 лет (24 чел) возраста, отобранных методом случайной выборки. Материалом для исследования служила цельная кровь, взятая у них из вены, которую отбирали в пробирку с ЭДТА, замораживали при -18о С и транспортировали в лабораторию в течение 30–60 минут после взятия материала. Кровь отбирали согласно Методическим указаниям «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории» МУ 4.2.2039-05 пункт 3. Доставленные пробы подвергали анализу на состав микробных маркеров с использованием хроматомасс-спектрометра АТ 5973 (газовый хроматограф с масс-селективным детектором серийного выпуска; Agilent Technologies Inc, США). Суть анализа состояла в прямом извлечении с помощью экстракции жирнокислотных соединений из образца крови, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке и анализа состава на масс-спектрометре. Цельную кровь (40 мкл) переносили в виал, емкостью 1,5 мл, с завинчивающейся крышкой и с тефлонированной прокладкой, подсушивали (при снятой крышке) в термостате при 80о С с добавлением 40 мкл метанола для ускорения сушки. К загустевшей пробе приливали 400 мкл 1М соляной кислоты в метаноле; кислый метанолиз вели при 80о С в течение 60 минут. К охлажденной реакционной среде добавляли 300 нг стандарта (дейтерометиловый эфир тридекановой кислоты), растворенного в гексане. Экстракцию проводили дважды путем внесения гексана (по 200 мкл) и последующего встряхивания смеси на вортексе, каждый раз позволяя реакционной смеси отстояться в течение 5 мин при комнатной температуре. Объединенный экстракт высушивали 5–7 мин при 80о С, а затем обрабатывали 20 мкл N,О-бис (триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при той же температуре и при закрытой крышке. К реакционной смеси добавляли 80 мкл гексана, после чего проба была пригодна для анализа на АТ 5973 в течение недели. Для отнесения маркеров к конкретным микроорганизмам наряду с авторскими данными (740 штаммов микроорганизмов) использована база данных (2000 штаммов) прибора Шерлок (MIDI Inc, Delaware, USA) для хроматографической идентификации микроорганизмов по жирным кислотам, а также другие литературные источники. АТ 5973 снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных; сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени пробоподготовки и расчета данных – не более 3 часов. Расчет концентрации маркеров и отнесение их к конкретным микроорганизмам проводили по программному продукту, поставляемому разработчиком. Результатом проведенных ГХМС исследований являлось установление маркеров, позволяющих судить о структуре и количественном содержании в пристеночной микробиоте кишечника обследуемых представителей 57 различных таксономических филотипов микроорганизмов. Статистическую обработку результатов одноименных показателей в каждой группе сравнения проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Различия в показателях считались достоверными, если они не менее, чем в два раза, отличались от референсных значений, полученных при обследовании крови здоровых молодых людей.

Результаты и их обсуждение

В таблице приведены данные ГХМС исследований крови 41 человека, касающиеся содержания 25 представителей пристеночной микробиоты кишечника у лиц зрелого/пожилого и преклонного возраста. Анализ этих данных свидетельствует о достаточной индивидуальности исследованных людей по структуре и количественному содержанию изученных таксонов бактерий, грибов и вирусов. При обсуждении микроэкологического профиля кишечника зрелых, пожилых и преклонных людей немаловажным является терминологическое определение понятия «старый» человек. По данным итальянских исследователей состав и функции микрофлоры толстой кишки у пожилых людей в среднем возрасте 70 лет относительно мало отличались от таковых взрослых молодых здоровых людей, что с микроэкологической точки зрения позволило ввести даже такое понятие, как задержанное старение («delayed aging»). Лишь у лиц старше 80–90 лет (centenarians) наблюдались отчетливые различия в структуре и функциях микробиоты толстого кишечника. Соотношение микроорганизмов, входящих в филогруппы Firmicutes и Bacteroidetes в содержимом толстой кишки у новорожденных, взрослых и пожилых людей составляет 0,4; 10,9 и 0,6, соответственно. К особенностям фекальной микробиоты лиц старших возрастных групп относят наличие в этом биоматериале повышенного количества оппортунистических патогенов (энтеробактерий, кандида, стафилококков) с одновременным уменьшением у старых и людей преклонного возраста бифидобактерий, появление в фекалиях достаточно большого числа атипичных вариантов доминирующих и субдоминирующих представителей симбиотической микробиоты, изменение соотношения лактатобразующих и бутиратсинтезирующих анаэробных бактерий. Какие-либо специфические маркерные виды микроорганизмов в фекалиях, характерные только для долгожителей (лиц старше 90 лет), не были обнаружены. Из наших данных, представленных в таблице, видно, что в группе лиц в возрасте 45–59 лет наибольшие отклонения (в два и более раз) от референсных значений (здоровые взрослые люди), отмечались по следующим таксономическим микробным филотипам: Eubacterium lentum, Peptostreptococcus anaerobius, Streptococcus mutans, Bifidobacterium, Propionibacterium/ Clostridium subterminale, Herpes-вирусам. При этом отмечалось как некоторое увеличение числа условно-патогенных микроорганизмов и вирусов, так и снижение представителей «полезной» микробиоты; к последним относят, прежде всего, бифидобактерии и лактобациллы. В группе людей в возрасте 75–90 лет наибольшие различия с референсными значениями имелись по представителям Lactobacillus, Eubacterium/Clostridium coccoides, Bifidobacterium, Propionibacterium/Clostridium subterminale. Дефицит Bifidobacterium, Propionibacterium/ C.subterminale наблюдался в обеих возрастных группах. В более старшей возрастной группе в пристеночной микробиоте снижалось разнообразие филотипов как «полезных», так и условно-патогенных микроорганизмов, что совпадает с результатами наблюдений за структурой фекальной микробиоты у лиц старше 75 лет. Связано ли это с особенностями питания этих лиц, «скудным» образом их жизни, или со старением организма, как биологическим процессом в целом, пока сказать невозможно. Хотя иммунная устойчивость лиц в группе 75–90 лет ниже, чем у более молодых людей, способность человека в этом возрасте выстраивать новые симбиотические взаимоотношения с возраст-трансформированной пристеночной кишечной микробиотой может быть важнейшим условием их долголетия. Использованная нами в работе ГХМС технология позволяла также определять в крови обследуемых лиц содержание эндотоксина и плазмалогена. Как известно, эндотоксин (микробный липополисахарид) является одним из важнейших факторов хронического воспаления, которое по последним данным, в значительной степени ответственно за ускоренное старение и развитие метаболических заболеваний, связанных с пожилым возрастом. Источником эндотоксина в организме млекопитающих являются грамотрицательные патогенные и оппортунистические бактерии, в первую очередь, энтеробактерии и бактероиды, широко представленные в составе фекальной микробиоты и, количество которых увеличивается с возрастом. Следует заметить, что некоторые исследователи отмечали заметное снижении пропорции представителей фила Bacteroides в общей массе фекальных микроорганизмов. По нашим данным, содержание эндотоксина в крови лиц 45–50 лет составляло 0,54 ± 0,22 мкг/мл, что было близким к референсным значениям для здоровых взрослых людей. Троекратно сниженное количество эндотоксина (0,18±0,07 мкг/мл) в крови у лиц старше 75 лет согласуется с нашими наблюдениями, что содержание грамотрицательных бактерий в пристеночном слое нижних отделов тонкого кишечника было крайне незначительно. Плазмалогены (плазменил-, плазманил-липиды) – это фосфолипиды/гликолипиды, широко представлены в клетках млекопитающих и у анаэробных бактерий. Кишечная микробиота является дополнительным (а возможно и основным) резервуаром плазмалогенов, поскольку эти соединения в значительном количестве синтезируются и присутствуют в составе мембран многих анаэробов (эубактерии, бифидобактерии, пропионобактерии, клостридии, бактероиды, десульфовибрио, руминококки, вейллонеллы, пропионибактерии, мегасфера и др.). В растениях и грибах плазмалогены не встречаются. Плазмалогены защищают от окисления полиненасыщенные жирные кислоты, участвуют в структуре и функциях мембран клеток млекопитающих и анаэробных бактерий, осуществляют межклеточные сигнальные функции и т.д. Хотя плазмалогены бактерий и эукариотических клеток функционально схожи, структурно они существенно различаются. Содержание плазмалогена в тканях мозга и биологических жидкостях существенно снижено у больных с неврологическими заболеваниями, связанными со старением, включая деменцию по типу болезни Альцгеймера. Данные наших исследований показали, что содержание бактериального плазмалогена в крови составляло 21,73±12,93 и 6,47±3,56 мкг/ 43 мл в первой и второй возрастных группах соответственно, что в два–семь раз ниже референсного значения (50 мкг/мл). Это позволяет рассматривать плазмалогены, как дополнительный биомаркер старения/ долголетия, в поддержании уровня которого анаэробная кишечная микробиота, синтезирующая данную группу липидов, может активно участвовать. Представленные в настоящем исследовании данные позволяют нам рекомендовать выявленные изменения в структуре филотипов пристеночной кишечной микробиоты, как четкие, воспроизводимые возраст – ассоциированные микроэкологические маркеры старения, а сам метод ГХМС как быструю технологию оценки профиля состава пристеночной микробиоты кишечника у людей зрелого/пожилого и преклонного возраста.

 Заключение

Объектом наших исследований являлась кровь лиц зрелого/пожилого и преклонного возраста, которую можно рассматривать как интегральный биоматериал, вобравший в себя соответствующие низкомолекулярные соединения (потенциальные микробные маркеры) на всем протяжении пищеварительного тракта. Спектр и количество низкомолекулярных субстанций (высшие жирные кислоты, спирты, альдегиды, эндотоксин, плазмалогены и др.) микробного происхождения в крови зависят от многих факторов: их способности преодолевать барьер слизистой кишечника и транслоцироваться в кровяное русло, возможностью и скоростью их утилизации в просвете кишечника эпителиоцитами и симбиотическими микроорганизмами кишечника, пропорционального содержания кишечных бактерий в структуре микробиоты в различных биотопах пищеварительного тракта, их локализацией в пристеночном (фиксированном состоянии) или в просвете кишечника (в плавающем состоянии). Дальнейшие исследования позволят установить, какие из перечисленных условий и в какой мере могут влиять на конечные результате ГХМС анализа крови, позволяющие установить микроэкологический профиль кишечника людей различного возраста. Наблюдения авторов первого применения ГХМС для оценки микробной экологии пищеварительного тракта человека, также как и наши данные, позволяют говорить, что эта технология способна достаточно объективно отобразить состояние пристеночной микробиоты в нижних отделах тонкой кишки (тощая, подвздошная) и начале толстой кишки (слепая кишка). Прямое сопоставление наших данных и результатов, полученных при исследовании фекалий вряд ли возможно и целесообразно, поскольку они направлены на изучении микробной экологии разных отделов пищеварительного тракта. Скорее следует говорить, что ранее опубликованные и наши данные информационно дополняют друг друга и расширяют наши знания, касающиеся микроэкологической характеристики пищеварительного тракта. Расширение спектра образцов биоматериала, взятых из различных отделов кишечника, и одновременное их исследование бактериологическим, молекулярно- генетическим, ГХМС и другими ОМИК-методами, дадут возможность более объективно оценивать состав и количественное содержание как доминирующих, так и минорных представителей микробиоты пищеварительного тракта на всем его протяжении у лиц, принадлежащих различным возрастным группам. Знания динамики и механизмов становления микробиоты в детстве и ее сукцессии в течение всей индивидуальной жизни (включая пожилой и преклонный возраст) создадут реальные предпосылки восстановления микроэкологического статуса конкретного человека в определенных условиях его жизни с использованием пробиотиков, пребиотиков,метабиотиков и синбиотиков. Оригинальным и перспективным микроэкологическим подходом поддержания здоровья и активного долголетия может стать также создание на территории РФ национальных криогеных банков с целью сохранения биоразнообразия кишечной микробиоты многочисленных этносов россиян и отдельных их представителей. На базе сохраняющихся при температурах от -80о С до -196о С (практически вечно) в неизменном состоянии индивидуальных симбиотических ассоциаций бактерий можно будет создавать аутопробиотики (пробиотики индивидуального применения) для аутотрансплантации кишечной микробиоты, которую, возможно, надо будет рекомендовать всем лицам, перешагнувшим возраст 45–50 лет. Внедрение в практику восстановительной медицины микроэкологической инженерии (направленное восстановление микробиоты людей пожилого и преклонного возраста) путем своевременного назначения им замороженной аутомикробиоты, взятой на хранение в молодом возрасте, открывает новые захватывающие перспективы в области создания программ активного долголетия.

Выводы

Использование метода хромато-масс-спектрометрии крови позволило установить структуру и количественный состав пристеночной кишечной микробиоты у людей в зрелом, пожилом и преклонном возрасте. У обследованных групп выявлены различия в содержании определенных таксономических микробных филотипов в микробиоте кишечника, а также в количестве эндотоксина и бактериального плазмалогена в плазме крови; особенно четко эти различия выявлялись у людей старше 75 лет. Метод ГХМС крови может быть рекомендован в качестве экспрессной технологии оценки профиля состава пристеночной микробиоты кишечника людей пожилого и преклонного возраста. Выявляемые микроэкологические различия могут рассматриваться в качестве биомаркеров старения и долголетия.

Комментировать