ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ДАННЫХ И ПОЖЕЛАНИЯ ЛЕЧАЩЕМУ ВРАЧУ ОТ РАЗРАБОТЧИКОВ МЕТОДА

Аннотация:

В основе метода МСММ лежит высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов микроорганизмов, а также являющихся их специфическими метаболитами, минуя стадии предварительного посева на питательные среды или использования тестовых биохимических материалов. Лабораторный этап исследований состоит из двух шагов: пробоподготовка биологического материала и непосредственно исследование на Микробиологическом анализаторе Маэстро (МБА).

 

Количественный метод позволяет быстро определять более 50 клинически значимых микроорганизмов (аэробы, анаэробы, актинобактерии, грибы, вирусы) непосредственно в клиническом материале, минуя стадии предварительного посева на питательные среды. Приводятся примеры эффективного использования технологии в клинической практике при некоторых заболеваниях.

 

Материал предназначен для гинекологов, урологов, педиатров, гастроэнтерологов, семейных врачей, хирургов, офтальмологов,инфекционистов, пульмонологов, отоларингологов, реаниматологов.

 

 

Понятие о микроэкологическом статусе человека и инфекции

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Каждая из применяемых современных методик имеет свои преимущества и ограничения, и лечащему врачу в рутинной работе приходится использовать совокупность результатов анализов, взаимодополняющих друг друга. Правильность постановки диагноза и корректность назначения терапии определяется полнотой и качеством данных, получаемых из клинических лабораторий.

 

Организм человека и населяющие его микроорганизмы – это единая экосистема, представленная совокупностью микробиоценозов, которые характеризуются определенным  видовым составом и занимают определенный биотоп в организме. Количество бактерий в организме человека составляет массу 2,5-3 кг, и это на порядок (1014) превышает число собственных клеток человеческого организма (1013).

Совокупность микробиоценозов в организме здорового человека существует как единое целое.

Это сообщество составляет нормальную микробиоту, которую рассматривают как самостоятельный орган, имеющий характерное строение – биопленку, покрывающую кишечную стенку, слизистые оболочки и кожу человека. Биопленка выполняет функцию неспецифического барьера.

Большинство бактерий в организме существует не в виде отдельных клеток, а в виде специфически организованных биопленок. Такое сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид – кольцевых ДНК, определяющих поведенческий код для членов биопленки, в том числе их трофические, энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Это называется– quorum sensing (социальное поведение). Реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке существенно отличается от реакции каждого отдельного вида в монокультуре.

Бактерии в биопленках демонстрируют повышенную выживаемость и устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, иммунной защиты и антибактериальных веществ. В частности биопленки способны выдерживать концентрации антибиотиков в 100-1000 раз превышающие терапевтические дозировки для подавления одиночных бактериальных клеток.

Хронические инфекции принципиально отличаются от острых образованием биопленок, и это  требует иного подхода к диагностике и лечению.

Нарушение микроэкологическогобаланса может приводить к патологическим проявлениям самого разного характера: кишечным расстройствам, кожным заболеваниям, половой дисфункции, сердечной недостаточности и др.

 

 

Описание технологии

Масс-спектрометрия микробных маркеров (МСММ)

Метод МСММ — это отечественная методическая разработка, не имеющая зарубежных аналогов. Для исследований используется оборудование отечественного производства – Микробиологический анализатор Маэстро (МБА, ООО «Интерлаб», Россия).

МСММ — наукоемкая технология

При ее разработке использованы данные из области хромато-масс-спектрометрии и химии липидов, молекулярной микробиологии  и микробной таксономии, микробиома и метаболома человека, взаимодействий в системе микробиота – хозяин, связи  кишечник – мозг, клинической микробиологии и медицины.

Математика и компьютерные технологии применены при разработке алгоритма трансформации микробного сообщества по суперпозиции микробных маркеров в нативном клиническом материале.

 

В основе методики масс-спектрометриимикробных маркеров (МСММ) лежит определение в анализируемой пробе особых химических компонентов (молекулярных маркеров) микробных клеток – видоспецифичных жирных кислот (ЖК), жирных альдегидов, входящих в состав фосфолипидов и липополисахаридов их клеточной стенки, а также структурных и метаболических стеринов в определении некоторых групп грибов и вирусов [Баранов, Осипов, 2009].

Принцип метода состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот из исследуемого образца, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре.

Так как содержание ЖК в клетках микроорганизмов данного вида одинаково и видоспецифично, то их концентрация в клиническом материале пропорциональна численности этого вида микроорганизмов.

 

Метод МСММ сходен с генетическим анализом (ПЦР, секвенирование 16S рРНК и др.), поскольку состав жирных кислот закодирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома. Известно, что хемо-дифференциация микроорганизмов по жирным кислотам, входящим в состав клеточной стенки коррелирует с их генетической классификацией. Результатом анализа является количественное определение того или иного таксона (род, вид) микроорганизмов в образце. По статистическому критерию [Осипов, 2005; Beloborodova, 2000] отклонения от нормы приобретают клиническую значимость, когда численность микроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой.

 

Принципиальное отличие методики МСММ – возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров, что позволяет оценить вклад от каждого из клинически значимых видов микроорганизмов. Пользователю не требуется самостоятельно оценивать результат количественных измерений для перехода от «приборных» величин к фактическому содержанию микроорганизмов в пробе. Специальное программное обеспечение МБА Маэстро использует автоматический алгоритм расчета для реконструкции состава микробного сообщества по набору обнаруженных маркеров, который представляет собой систему уравнений, учитывающую возможность происхождения маркеров из клеток разных таксонов.

По сравнению с традиционными методами бактериологического исследования использование методики МСММ позволяет значительно сократить время и стоимость исследования, минуя стадии культивирования и тестовых ферментаций, которые особенно сложны и трудоемки для анаэробов.

Фундаментальным результатом клинических приложений методики МСММ, является подтверждение количества микроорганизмов в теле человека – порядка 1014клеток (в основном в кишечнике), что было подтверждено другими методами. Кроме этого, удалось определить состав микробиоты непосредственно в кишечнике и показать его гомеостатичность, что до сих пор только предполагалось из исследований и обобщений ряда ученых, работающих в области медицинской микробной экологии.

Научная обоснованность методики подтверждена патентами на изобретение, диссертациями, публикациями в научной периодике, в том числе в иностранных рецензируемых журналах, в методических пособиях и монографиях. В настоящее время методика используется в ряде российских клиник для обнаружения воспалений неизвестной этиологии, при раневой и послеоперационной инфекции, перитоните, септических состояниях, лихорадках, заболеваниях респираторной и мочеполовой сферы.

В 2010 году Росздравнадзор одобрил применение методики в качестве новой медицинской технологии «Оценка микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).

Диагностические возможности методики позволяют использовать ее как приоритетное направление для 4П-медицины.

 

Сравнение методов микробиологических исследований

Методы микробиологического анализа, применяемые на сегодняшний день в клинической практике, имеют определенные ограничения и недостатки.

Культуральный

Микроб надо вырастить в искусственной среде.

Трудоемкость, дороговизна, длительность (до 10 суток). Невозможность оценить роль некультивируемых микроорганизмов, прежде всего – анаэробов.

 

Масс-спектрометрический

Такое же ограничение присуще и современной высоко-технологичной масс-спектрометрической методике идентификации микроорганизмов по технологии МАЛДИ (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization). Безусловным достоинством этого подхода является возможность детектирования микроорганизма с точностью до штамма всего за 20 секунд. Однако, необходимость получения первичной культуры (все нюансы проведения преаналитического этапа), по сути, приводит нас к тем же вопросам о соответствии результата и реальной этиологии инфекционного процесса. Естественно, с учетом прекультивирования, иначе оцениваются затраты временные/материальные на анализ.

 

Иммуносерологический

Непрямой метод, поскольку выявляет не возбудителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации

 

ПЦР

Вероятность ложноположительных результатов (из-за высокой чувствительности) и ложноотрицательных результатов (амплификация погибшего микроорганизма), констатация лишь наличия/отсутствия микробных тел, поэтому трудно адекватно оценить с точки зрения клинической практики

 

Секвенирование генов 16SрРНК

Ошибки, свойственные ПЦР, широкий разброс оценок разнообразия видов, неспособность оценить биологические функции видов

Основные преимуществаметода ГХ-МС

 

Широкий диагностический спектр

  • Выявление более 100 микробных маркеров в одной пробе
  • Определение численности более 50 клинически значимых микроорганизмов одновременно в одном анализе

 

 

Уникальность

  • Идентификация микроорганизмов, редко культивируемых в клинической практике: анаэробы (Clostridium, Eubacterium, Propionibacterium), актинобактерии (Streptomyces, Nocardia, Rhodococcus),
  • Оценка состояние микробиоты кишечника по анализу крови.
  • Диагностика хронических и латентных инфекций в режиме реального  времени

 

Универсальность

  • Определение разных групп микроорганизмов, включая трудно культивируемые аэробы, анаэробы, актинобактерии, грибы и вирусы;
  • Клинический материал любых органов и локализаций:

Венозная/капиллярная кровь, мазок из зева (ротоглотки), мазок с кожных покровов, мазок с конъюнктивы, мазок из носоглотки, мазок из уретры, мокрота, ногти, отделяемое влагалища, отделяемое раны, секрет простаты, слюна, моча, кал.

  • Определени любого микроорганизма, имеющего  в достаточном количестве клеточных компонентов, специфичных для возбудителя
  • Широкий диапазон условий транспортировки
  • Нет необходимости сохранять живые микроорганизмы в пробе
  • Можно хранить пробу в холодильнике при +4 С в течение 24 часов,
  • Можно замораживать.

 

Экспресс-диагностика:

  • Время анализа не более 2-х часов
  • Высокая скорость анализа позволяет проводить мониторинг лечения и быструю  корректировку при необходимости.

 

Высокая чувствительность

  • Чувствительность метода: 104–105клеток в пробе, в зависимости от содержания маркера в клетке
  • Минимальная детектируемая концентрация маркера– 0.01 нг/мл
  • Количественный анализпозволяет отследить динамику инфекции, дисбиоза и миккроэкологического статуса организма человека.
  • Концентрация маркера из состава клеточной стенки микроорганизма прямо пропорциональна численности микроорганизмов в пробе.

 

Селективность:

  • Определение микроорганизма до вида – при наличии видового маркера
  • Возможность прямого анализа клинических образцов без высевания

 

Экономичность

  • Сокращается время и стоимость исследования
  • Не требует культуральных сред, ферментов, праймеров

 

 

 

Метод МСММ позволяет врачу:

  • Получить информацию о расширенном составе микробного сообщества, о трудно культивируемых микроорганизмах(анаэробы) в образце биоматериала
  • Выявить основные патогены в составе полимикробной инфекции
  • Значительно сократить время подбора рациональной антибактериальной терапии и пробиотикотерапии или подбор метабиотика
  • Отследить терапию в динимике. Увидеть в «цифрах» изменение в количественном составе микроорганизмов
  • Уменьшить число гнойно-септических осложнений и улучшить исход заболевания
  • Сократить сроки госпитализации
  • Дополнить бактериологическое исследование и/или использовать как скрининговый метод
  • …и как результат сократить стоимость лечения и время пребывания пациента в стационаре

 

 

Показания к применению

  • Определение микроэкологического статуса организма и его отклонений
  • Выявление или уточнение этиологии инфекционно-воспалительного процесса при любых нозологических формах заболеваний в клинической практике
  • Диагностика хронических и латентных инфекций в режиме реального  времени

 

В клинической диагностике использование метода рекомендовано для следующих категорий пациентов:

ОРИТ: сепсис, гнойно-воспалительные очаги, лихорадка неясной этиологии, менингит, бактериурия, полиорганная недостаточность

Хирургия: инфекция вследствие хирургического вмешательства, гнойно-воспалительная инфекция, абсцессы почек и печени, воспалительные процессы респираторных органов, воспаление внутренних половых органов, ожоговая инфекция, гангрена,перитонит, синовит

Гинекология: хронический вагинит, цистит, воспаление матки и придатков,кандидоз истинный и ложный, невынашивание беременности

Урология и андрология: пиелонефрит, буллезный цистит, уретрит, простатит, орхит,гонорея

Репродукции и планированиясемьи: мужское и женское бесплодие, связанное с инфекциями половых органов

Гастроэнтерология: синдром раздраженного кишечника, гастрит, дисбактериоз пристеночной кишечной микробиоты, диарея, запор, болезньКрона

Пульмонология: муковисцидоз, пневмония, туберкулез, плеврит, лихорадка неясного генеза

ЛОР: гайморит, синусит, фарингит, отит

Кардиология: эндокардит, врожденный порок сердца, инфекция в области хирургического вмешательства

Иммунология и генетика: муковисцидоз, средиземноморская семейная лихорадка, СПИД (инфекционные последствия — вторичная инфекция), атипическая пневмония

Гепатология: асцит, дисбактериоз, спонтанный бактериальный перитонит

Дерматовенерология: угревая болезнь, атопическая экзема, себорея, онихомикоз, псориаз, дерматиты неясной этиологии, сифилис

 

Клиническая процедура детектирования микробных маркеров выглядит следующим образом:

  • Определение биологических проб, подлежащих анализу в соответствии с диагнозом или симптомами заболевания, если диагноз отсутствует
  • Проведение анализа по полному алгоритму масс-спектрометрии микробных маркеров
  • Составление заключения молекулярного микробиолога (врача-интерпретатора) по особенностям результатов анализа
  • Анализ специфики заболевания и связанных с ним микроорганизмов с измененной концентрацией и оценка их причастности к конкретной патологии
  • Выбор антибиотика в соответствие с чувствительностью по  первичному  анализу.
  • Назначение  антибиотиков  производится  в  отношении  микроорганизмов, проявляющих избыточный рост  –  увеличение численности более чем вдвое по сравнению с нормой.
  • Спустя  сутки  после  достижения  терапевтической  концентрации  антибиотика производится повторный ГХ-МС анализ. На основании повторного анализа определяется эффективность назначения  и  проводится  его  коррекция  с  учетом  микроорганизмов,  не изменившим численность, а тем более обнаруживающих ее наращивание или конкурентный рост,  как  оппортунистическая  микробиота.  Экспрессность  метода позволяет мониторировать лечение.
  • Определение других мер для восстановления гомеостатической нормы органа или микроэкологического статуса организма пациента в целом, включающих иммуностимуляторы, пробиотики, пребиотики, энтеросорбенты, микроэлементы, диета и т.п.
  • Мониторинг терапии и коррекция лечения при необходимости

 

Интерпретация результатов

Отклонения от нормы приобретают клиническую значимость, когда численность микроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой (по статистическому критерию для крови [Beloborodova, 2000] и урогенитальных органов [Осипов, 2005]) .

Результат выдается в виде списка определяемых микроорганизмов, допустимых значений нормы и отклонений от нормы, цветовой маркировки «превышений» и «дефицита», а также диаграммы в сопоставлении с нормой. Также прилагается заключение в виде справочной информации по результатам анализа.

В качестве примера результата представлена диаграмма МСММ, отражающая микробиомтощей кишки по крови.

 

Рисунок.1.Общий вид Страницы 1 отчета.

В зависимости от типа образца отчет содержит три или четыре листа. Три листа содержат отчеты для образцов синовиальной жидкости, бронхоальвеолярного лаважа, смыва трахеи, эякулята, секрета простаты, мазка из уха, отделяемого глаза и носа, дренажа, раневого отделяемого, соскоба кожи, мочи и фекалий. Четыре листа в отчетах для образцов аспиратов из матки, крови, биоптатов тканей, мазков из цериквального канала, уретры, зева, а также вагинального содержимого и слюны.

 

 

Страница 1 (см. Рисунок 1) приводит результаты количественного в единицах числа клеток на единицу объема (105кл/мл). При наличии показателя «норма» (среднее значение фоновых маркеров микроорганизмов, которые могут обнаруживаться в биоматериале в отсутствие патологии) для исследованного образца, результат приводится в соответствии с нормой и отражается на наглядной диаграмме.

Страница 2 содержит автоматически формируемое Заключение по пробе, поля для примечаний и сведения об операторе (см. Рисунок 2). Фактически в Заключении приводятся сжатые результаты количественного анализа с Листа 1, где перечислены только микроорганизмы, на которые следует обратить особое внимание лечащему врачу.

Страница 3 (см. Рисунок 3) является вспомогательным и содержит последние литературные данные о чувствительности к антибактериальным препаратам со ссылкой на источники. Поля микроорганизмов, обнаруженных в количестве, превышающем уровень клинической значимости, автоматически выделяются цветом.

Рисунок 2. Общий вид (фрагмент) Страницы2 отчета.

Рисунок 3. Общий вид (фрагмент) Страницы3 отчета.

Страница 4 (см. Рисунок 4) представляет собой «диаграмму дисбиоза» и визуализирует отклонения от нормы в сторону превышения численности (инфекции) или дефицита мониторируемых микроорганизмов. Страница приводится для образцов из биотопов, описанных с точки зрения состава микробного сообщества, которые не только имеют охарактеризованные значения фоновых маркеров, как нормы, но и имеют микробиоценоз определенного состава у здоровых людей, отклонение от которого («дисбиоз») является угрозой возникновения патологических процессов, в том числе инфекционного характера.

Рисунок 4. Общий вид (фрагмент) Страницы4 отчета.

Оценка микробиоты кишечника по анализу крови

Наибольшей информативностью при оценке микроэкологического статуса организма является  исследование именно пристеночной микробиоты кишечника (мукозная микробиота), а не микробиоты фекалий.

Согласно исследованиям, гомеостаз микробных маркеров в крови (Осипов, 2003) соответствует профилю кишечной микробиоты, что обеспечивает  уникальную возможность мониторировать состояние микробиоты кишечника по анализу крови.

Наличие маркеров микроорганизмов в крови обусловлено механизмом иммунного ответа на появление возбудителя. Фагоцитирующие клетки адсорбируют и перерабатывают антигены микроорганизмов и выводят продукты лизиса в лимфатическую и кровеносную систему. Учитывая, что большая часть фагоцитирующих клеток крови находится в межклеточном пространстве и свободно проходит через стенки сосудов, исследователи полагают (предполагается), что независимо от очага воспаления микробные маркеры постоянно и быстро поступают в кровь вместе с фагоцитами и белками переносчиками. То есть наличие микробных маркеров в крови отражает состав микробных сообществ тела человека, независимо от места обитания микроорганизмов или очага воспаления. Таким образом, компоненты микробных клеток могут быть определены в крови  чувствительным аналитическим методом, каковым является метод ГХ-МС. При этом активные микробные клетки в крови отсутствуют, посев крови на питательные среды, как правило, дает отрицательный результат, за исключением случаев бактериемии.

Одновременное исследование крови пациентов показало соответствие состава микробных ЖК, альдегидов и стеролов в биоптате тонкой кишке и в крови. Показана количественная адекватность изменений их концентраций при дисбактериозе, ассоциированном с синдромом раздраженной тонкой кишки, болезнью Крона и псориазом (Осипов, 2003). Это означает возможность неинвазивной оценки изменений микробиоты кишечника по данным анализа крови методом МСММ.

Рисунок 5. Сопоставление концентрации маркеров микроорганизмов в кишечной стенке и крови

 

Интерпретация данных МСММ

Клиническая процедура при использовании МСММ претерпевает существенные изменения, связанные с увеличением объема микробиологической информации по каждой пробе больного, сокращением времени анализа до трех часов, вместо недель и появлением в результатах непривычных для микробиолога и врача редко культивируемых микроорганизмов – большинства анаэробов, актинобактерий и других. В период накопления нового клинического опыта, необходимого для разработки оперативных алгоритмов решения и их формализации в виде протокольных разрешительных документов (методик, пособий, статей в Госреестре и т.п.) она выглядит следующим образом: Клиническая процедура детектирования микробных маркеров  выглядит следующим образом:

  • Определение биологических проб, подлежащих анализу в соответствии с диагнозом или симптомами заболевания, если диагноз отсутствует
  • Проведение анализа по полному алгоритму масс-спектрометрии микробных маркеров
  • Составление заключения молекулярного микробиолога (врача-интерпретатора) по особенностям результатов анализа по особенностям результатов по отношению к норме и их значимости
  • Анализ специфики заболевания и связанных с ним микроорганизмов с измененной концентрацией и оценка их причастности к конкретной патологии
  • Поиск информации в собственной базе данных или Интернет по специфике заболевания и связанных с ним микроорганизмов с измененной концентрацией и оценка их причастности к конкретной патологии
  • Выбор антибиотика по данным рапорта МСММ или поиск в Интернет, если необходимо подавление избыточного роста численности микроорганизма при воспалениях, сепсисе, инфекциях ткани и избыточном росте микробиоты кишечника или УГТ и прочего
  • Назначение вобензима и других препаратов для разрушения биопленок патогенных бактерий.
  • Назначение  антибиотиков  производится  в  отношении  микроорганизмов, проявляющих избыточный рост  –  увеличение численности более чем вдвое по сравнению с нормой.
  • Спустя  сутки  после  достижения  терапевтической  концентрации  антибиотика производится повторный ГХ-МС анализ.  На основании повторного анализа определяется эффективность назначения  и  проводится  его  коррекция  с  учетом  микроорганизмов,  не изменившим численность, а тем более обнаруживающих ее наращивание или конкурентный рост,  как  оппортунистическая  микробиота.  Экспрессность  метода позволяет мониторировать лечение.
  • Выбор стимуляторов роста микробов, если их дефицит угрожает нарушением физиологического гомеостаза макроорганизма
  • Определение других мер для восстановления гомеостатической нормы органа или микроэкологического статуса организма больного в целом, включающих иммуностимуляторы, пробиотики, пребиотики, энтеросорбенты, микроэлементы и т.п., а также диетические и процедурные назначения, нормализующие деятельность кишечника и других органов, содержащих слизистые оболочки или иные компартменты обитания симбиотноймикробиоты
  • Контроль за реакцией больного на принятую терапию – мониторинг и коррекция лечения

Традиционно, врач получает данные посева баклаборатории, где указаны один-три микроба и чувствительность к антибиотикам в чашке Петри. Свойства микробов знать не обязательно. При анализе данных МСММ это знание становится важным. В особнности тех микробов, которые не определяют в рутинном баканализе. Анаэробы – особенно – клостридии, актинобактерии – стрептомицеты, нокардии.  Становится важным количественный фактор – рейтинговая позиция микроба в рапорте и его патогенетическая активность.

Группа мажорных значений результатов представляет основную микробиоту («микрофлору») тощей кишки – бифидобактерии, лактобациллы, эубактерии, пропионобактерии, клостридии. Это основной микроэкологический статус пациента. В списке микроорганизмов второго плана обычно присутствуют маркеры микроорганизмов инфекционной составляющей, маркеры, которые поступают в кровь из инфицированных органов. Пожелание лечащему врачу – связать эти возможные агенты инфекции с клиникой пациента и назначить этиотропную антибиотикотерапию, руководствуясь нашим приложением, содержащим сведения из литературных данных и справочников.

По первичному анализу назначение антибиотиков производится в отношении микроорганизмов, проявляющих избыточный рост – увеличение численности более чем вдвое по сравнению с нормой. Метод МСММ подтверждает, что в зоне воспаления можно обнаружить весь списочный состав микробов организма человека. Измерения методом масс-спектрометрии микробных маркеров in situ  выявляет новую группу микроорганизмов из числа трудно культивируемых, и поэтому, мало известных в клинической практике.  Эти участники инфекционного процесса — клостридии, эубактерии, лактобациллы, хеликобактеры, стрептомицеты, родококки — обладают высокой патогенетической активностью. Она известна из специфически связанных с этими организмами нозологий, каждая из которых воспринимается сама по себе как серьезное заболевание, трудно поддающееся лечению. Клостридии групп C. perfringens и C. ramosum (группа RIC – ramosum, inocuum, clostridioforme) – это гангрена, Eubacterium – септический артрит, Lactobacillus – септицемия и эндокардит, H. pylory –язвенная болезнь желудка, языка и атеросклероз; Streptomyces и другие актинобактерии — туберкулез, нокардиозы и актиномикозы.

Метод МСММ дает уникальную возможность определять чувствительность к ан-тибиотикам invivo путем сопоставления анализов до приема антибиотика и после, через два-три дня. Причем сразу по всем микробам. Те, что чувствительны – сократились в численности, а резистентные ее сохранили или даже увеличили.

Не допускать перехода инфекции в сепсис

Применительно к сепсису экспрессный в реальном времени мониторинг инфекции одновременно по всем клинически значимым микроорганизмам означает просто-напросто недопущение септического состояния как такового за счет применения адекватной антибиотикотерапии при первых признаках нарастания какого-либо агента инфекции.

При ведении пациентов ОРИТ под контролем МСММ само понятие сепсиса перестанет существовать. Микробы как бы говорят своими молекулами из состава клеточной стенки или специфическими метаболитами: Берегитесь – мы начали размножаться.  Отпадает необходимость в таких маркерах сепсиса, как прокальцитонин или пресепсин, поскольку лучшими специфическими маркерами инфекции является сама инфекция, ее микробные маркеры, попадающие в кровь, а еще лучше – маркеры, определяемые в материале из пораженных органов.

24 вида биопроб для МСММ

Настоятельно рекомендуем назначать  анализы слюны, мочи, секретов УГТ, мазки из зева, пунктаты, биоптаты и прочее.

Анализ слюны приобретает особое значение при неврологических заболеваниях. Опыт показывает, что в слюну поступают маркеры микроорганизмов, инфицирующих ЦНС – область мозга и позвоночника. Назало-энцефалический барьер проницаем для микробных маркеров и самих микробов.

Как восстанавливать нарушенный баланс микробной биопленки

Антибиотики – если избыточный рост микроорганизмов.Общеизвестно и общепринято суждение о снижении популяции нормальной микробиоты кишечника под действием антибиотиков. Однако это нельзя считать корректным и доказанным, так как на самом деле основанием для такого вывода послужили анализы фекалий, а не пристеночной микробиоты. Применение метода МСММ в клинической практике показало, что  отнесение дисбиоза за счет антибиотикотерапии  следует рассматривать во вторую очередь, отдавая предпочтение другим стрессовым факторам. Стресс травматический, криминальный, экологический, эмоциональный. По данным наблюдений в НИИ скорой помощи им. Склифосовского, любой стресс приводит к снижению общего уровня колонизации стенки тощей кишки до десяти раз. В процессе лечения, несмотря на интенсивную АБТ, септический шок и операции микробиом приблизижается к норме. Самым красноречивым подтверждением вторичности участия антибиотиков является опыт по воздействию экстремальных доз ампициллина на крыс. Их микробиота оказалась устойчивой к этому препарату. Так же, как устойчива биопленка псевдомонад к действию антибиотиков invitro.

Антибиотики можно безопасно применять для коррекции дисбиозов в пределах  доз, указанных в аннотации.

Другой проблемой АБТ является преодоление возрастающей резистенции к антибиотикам бактерий, фигурирующих в качестве ключевых возбудителей инфекции в практике клинических бактериологических лабораторий. То есть разного рода аэробов, способных быстро расти на искусственных средах.

Одним из способов преодоления резистенции микробов — это переключение на реальных патогенов – анаэробов, актинобактерий, грибов и вирусов в дополнении к аэробам культивируемым в рутинных клинических лабораториях. Данные МСММ подтверждают, что инфекция полимикробна и что тело человека само оказывается основным источником микробов, преимущественно – анаэробов. Многочисленные исследования показывают, что влияние аэробов вторично в этиологии инфекции. В то же время анаэробы родов  Clostridium, Eubacterium, Peptostreptococcus, Actinomyces и актинобактерии Streptomyces, Nocardia, а также грибы типа Aspergilus доминируют в полимикробной инфекции. Путь к эффективной антибиотикотерапии (АБТ) лежит через детектирование ключевых микробов некультуральными методами, в особенности методом масс-спектрометрии микробных маркеров  (МСММ).  Поэтому, не стоит преодолевать устойчивость к антибиотикам стафилококков и энтеробактерий при септической или раневой инфекции или псевдомонад при муковисцидозе.  Лучше сконцентрироваться на противостоянии главным микробным агентам.

Жидкие пробиотики для стимуляции роста. Коррекция на уровне связи микробиота – эпителий – кишечный мозг. Иммунные препараты. Препараты висмута – де-нол и другие. Метронидазол. Флавоноиды.

Метабиотики- в настоящее время считаются наиболее эффективным средством восстановления нарушенной микробиоты [Шендеров, 2017]. Это теоретически обосновано, так как по генетическим представлениям сами микробы пробиотических культур не могут по малости численности и чужеродности приживаться в мукозном слое кишечника. Логично полагать, что стимулирует восстановление собственной микробиоты биокаталитическое действие метаболитов культуральной среды.

 

*Низин, стафилококцин, томицид (антимикробные препараты бактерицинового типа)

*Хилак-Форте (смесь ЛЖК, молочной кислоты, некоторых витаминов и других микробных продуктов кишечных палочек, стрептококков и лактобацилл)

*Бактистатин (смесь микробных протеаз, амилаз, лизоцима, каталазы, полипептидов, пептидогликана, некоторых аминокислот, полисахаридов, присутствующих в культуральной жидкости Bacillussubtilus, не содержащих живые бактерии, + сорбент цеолит)

*Хелинорм (инактивированные клетки пробиотических бактерий Lactobacillusreuteri, способные специфически связываться и выводить Helicobacterpylori естественным путём);

*Актофлор С (ауторегулятор роста и развития эукариотических и прокариотических клеток на основе ацетата, лактата, сукцината, формиата, лизина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, валина, метионина, аланина, лейцина, глицина)

*Дайго (Daigo) – (смесь пептидов – биорегуляторов, изолированных из культуральных жидкостей 16 штаммов лактобацилл [L.curvatus, L.casei, L.acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, L.salivarius, L.brevis, L.rhamnosus]), выращенных в течение года на соевом молоке

*Eschericiacoli гликопротеин с аноректической активностью

*L. сasei полисахарид-гликопептид с гипотензивным эффектом

*Lactobacillushelveticusтрипептид с гипотензивным эффектом

*Закофальк (комбинация бутирата натрия и инулина)

*Аципол (препарат на основе живых лактобацилл (L.acidodophilus), обогащенный полисахаридами кефирных грибов)

 

Примеры использования технологии в клинической практике

Синдром раздраженного кишечника

При синдроме раздраженного кишечника (СРК) наблюдается тотальный дефицит кишечной микробиоты до семикратного снижения общей численности микроорганизмов (рис.2.). Это происходит в основном за счет уменьшения численности лактобацилл, бифидобактерий, лактобацилл, бифидобактерий, основной группы эубактерий и пропионобактерий при избыточном росте других эубактерий и стрептококков.

Кроме того, растет численность анаэробов Bacteroides fragilis, Porphyromonas, Propinobacterium acnes, при периодическом избытке энтеробактерий, клостридий группы C. ramosum и Eggertella lenta, атакже Campylobacter mucosalis, энтерококков, псевдомонад, Acinetobacter, бацилл и стрептококков. Эта группа микробов, вероятно, является источником токсинов, поддерживающих заболевание при дефиците основных представителей нормальной микробиоты.

Рисунок 6.Диаграмма МСММ при синдроме раздраженного кишечника.

 

 

Инфекции урогенитального тракта у женщин

Гонококковый вагинит. В вагинальном секрете и соскобах присутствуют маркеры Neisseria и сопутствующей в таких случаях анаэробной микрофлоры (Peptostreptococcus, Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Selenomonas). В то же время занижено содержание Lactobacillus, Bifidobacterium, некоторых Clostridium, Ruminicoccus, Actinomyces, части Eubacterium и других микроорганизмов нормофлоры, что характеризуетвагинальныйдисбиоз.

Синергизм актинобактерий и кокков. Превалируют аэробные актиномицеты (Streptomyces, Nocardia и др.) со Streptococcus, Bifidobacterium и Ruminicoccus. В числе кокков – Rhodococcus equi, который рассматривают как внутриклеточный условный патоген (аналог гонококка, но менее вирулентный – обычно встречается

у мужчин при простатите).

Ложный кандидоз. При отсутствии Candida albicans похожую клинику дает Clostridium perfringens. Превышают норму маркеры анаэробных бактерий C. perfringens и Propionibacterium spp. Завышено содержание маркера Staphylococcus epidermidis.

Энтеробактерии. Эндотоксинемия. Ведущими являются грамотрицательные микроорганизмы, преимущественно сем. Enterobacteriaceae, которые создают высокие концентрации эндотоксина как в локусе, так и в крови.

Микоз, без участия кандиды. Существенно превышают норму маркеры микроскопических грибов,

продуцирующих кампестерол и ситостерол, а также Staphylococcus aureus и Clostridiump ropionicum и Clostridium perfringens. Ниже нормы количество многих бактерий, в том числе Lactobacillus и Bifidobacterium (дисбиоз).

 

Невынашивание беременности, неудачи ЭКО

У женщин с проблемами беременности или неудачами ЭКО методом МСММ выявляется существенное превышение нормы «скрытыми» (от рутинных методов) компонентами нормальной микробиоты: Clostridium perfringens, Helicobacter pylory, Streptomyces, Eubacterium. При наличии такого рода токсигеннных микроорганизмов, а тем более при одновременном их присутствии, вряд ли будет возможным развитие оплодотворенной яйцеклетки в полноценный плод и нормальное протекание беременности.

Рисунок 7. Избыточный рост микроорганизмов в соскобе полости матки методом МСММ, источник: http://www.poliklin.ru/imagearticle/201302_LAB/68-73.pdf

 

Инфекционный простатит

  • По данным МСММ в эякуляте в норме доминируют маркеры анаэробов кишечной группы – эубактерии, клостридии, лактобациллы, пропионобактерии.
  • Причем более половины общей численности составляют эубактерии. В эякуляте максимальная концетрация альдегидов — маркеров анаэробов – по сравнению с биологическими жидкостями других органов.

Следовательно – максимальная концентрация плазмологена, который предположительно ответственен за двигательные, навигационные и сенсорные функции сперматозоидов.

  • Десять микробов из числа 50 контролируемых почти в 100 % случаев (n=100) превышают уровень клинической значимости
  • Это Streptomyces, Fusobacterium/Haemophylus, Rhodococcusequi, Streptococcus, Enterobacteriaceae spp, Staphylococcus spp, Enterococcus, Eubacterium и микроскопические грибы.
  • Часто втречаются серьезные клостридии из групп Clostridiumperfringens, C. ramosum и C. tetany
  • Остальные микробы более или менее часто сопутствуют этой основной группе, представляющей специфическую смешанную инфекцию при простатите.

 

Пиелонефрит

В моче доминируют маркеры анаэробов Propionibacterium freudenreichii, клостридий (C. hystolyticum и С. propionicum), специфичных для кишечника (Рис.1). Значительно повышена концентрация маркеров Alcaligenes, Pseudomonas aeruginosa и Moraxella. Кишечные микроорганизмы создают мукус повышенной вязкости (в присутствии P. freudenreichii), способствующий размножению многочисленных видов микроорганизмов и препятствующий обменным процессам.

Рисунок 8. Диаграмма МСММ в моче при пиелонефрите (микст-инфекция)

 

Муковисцидоз

В мокроте пациентов наряду с наличием традиционно известных агентов муковисцидоза (псевдомонады, стафилококки и др.) обнаруживаются маркеры анаэробов рр. Сlostridium, Eubacterium, Propionibacterium, Actinomyces и др. Анаэробы доминируют в микст-инфекции

Рисунок 9. Диаграмма МСММ в мокроте больных муковисцидозом

 

 

Микробные маркеры в крови при септических состояниях. Пример мониторинга

 

По данным изменений основными патогенами в количественном отношении (от 5х107 до 3х108) следует считать клостридии группы  Clostridium ramosum, оральные стрептококки, анаэробный пептострептококк и нокардии. Второй уровень, менее  2х107 составляют Clostridium perfringens, группы Bacillus cereus и Moraxella/Acinetobacter, а также стафилококки и псевдомонады.

 

Эти изменения можно наглядно видеть на графиках рис 10 и 11 соответственно.

Рисунок 10. Мажорные составляющие инфекции в мониторинге микроэкологического статуса больного Че-ва.

Рисунок 11. Минорные составляющие инфекции в мониторинге микроэкологического статуса больного Че-ва.

 

Мониторинг состояния микробиоты до септического шока (18.02.2011) позволяет выявить провоцирующие его микроорганизмы. За две недели до шока (это ранняя диагностика!) наблюдается рост концентрации маркеров Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes и стафилококков, хотя последние остаются ниже обычно наблюдаемого уровня у здоровых людей, но обнаруживают тенденцию к росту.

Анализ фракции карбоновых кислот из (тоже ГХ-МС методом) плазмы крови в те же дни показал в предшоковый период рост концентрации молочной килоты (продуценты лактобациллы, бифидобактерии, клостридии, эубактерии), щавелевой, 2-гидроки-изовалериановой (клостридии, Carlier,1989), фенилмолочной (C. perfringens, Eubacteriumlentum, Белобородова, 2011) что согласуется с пиком концентрации клеточных маркеров клостридий группы C. perfringens и E.lentum а также началом подъема концентрации маркеров группы C. ramosum при многократном дефиците лактобацилл и бифидобактерий в общем микроэкологическом статусе пациента.

В период септического шока достигает максимума концентрация молочной кислоты – к ее продукции подключается  пептострептококк. В максимуме также маркеры щавелевой, 2-гидроки-изовалериановой, фенилмолочной кислот. В этот период максимальны 2-гидрокси-изомасляная (клостридии), пара-гидроксифенил-молочная, 2-гидрокси-гексановая, яблочная, 3-гидрокси-масляная, декановая, капроновая, кето-изокапроновая, каприловая, бензойная, гидрокси-уксусная и пара-гидроксифенил-уксусная (Bacteroides fragilis) кислоты.

 

Увеличение концентрации маркеров Blautia coccoides, Bacillus cereus и вируса герпеса в постшоковый период можно рассматривать как оппортунистическую инфекцию. Обычные оппортунисты – кандида и микроскопические грибы, определяемые по появлению в крови их стероидных метаболитов – ситостерола и кампестерола, тоже проявляют рост. Однако он происходит в пределах нормальных значений концентраций маркеров в крови, поэтому можно считать это восстановлением нормальной микробиоты организма.

 

 

Выводы

  • Инфекции в подавляющем большинстве случаев –  полимикробны, вызываются сообществом микроорганизмов, объединенным в биопленку.
  • Как правило, доминируют анаэробы.
  • Диагностика возбудителей инфекционных заболеваний методом  масс-спектрометрии является быстрым, чувствительным и универсальным методом индикации, одинаково эффективным как для аэробных, так и для анаэробных микроорганизмов, актинобактерий, а также некоторых грибов и вирусов..

 

Список литературы:

  1. Оценка микроэкологического статуса человека методом хроматомасс-спектрометрии. / Баранов В.М., Осипов Г.А., Мухамедиева Л.Н., Белобородова Н.В., Пахомова А.А., Родионова Т.А. // Новая медицинская технология. МЗ РФ № НЮ-40006, 17.08.2009.
  2. Г.А. Осипов, Г.Г. Родионов. Применение метода масс-спектрометрии микробных маркеров в клинической практике. ЛАБОРАТОРИЯ № 2, 2013. С.68-73.
  3. Годков М.А., Осипов Г.А., Федосова Н.Ф., Лядов К.В. Возможности масс-спектрометрии микробных маркеров в лабораторном мониторинге дисбиозов и инфекций. Справочник заведующего КДЛ. 2011, № 7, С. 35-44
  4. Методика определения микроорганизмов при инфекции кожи и сопутствующемдисбиозе кишечника по химическим маркерам с применением метода хромато-масс-спектрометрии. Учебно-методическоепособие. Москва, 2009
  5. Beloborodova N.V., Osipov G.A. 2000. Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship. Ecol.Heal.Dis., SCUP, 12: 12-21.
  6. Осипов Г.А., Крымцева Т.А., Осипов Д.Г., Столярова О.Н. Функциональные изменения жирнокислотного состава урогенитальных жидкостей организма человека при дисбиозах. Прометей. Москва, 2005, 85с.
  7. Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально-биохимическом и хромато-масс-спектрометрическим методами. / Осипов Г.А., Парфенов А.И., Верховцева Н.В., Ручкина И.Н., Курчавов В.А., Бойко Н.Б., Рогатина Е.Л. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2003. № 4. С. 59-67
  8. Шендеров Б.А. МЕТАБИОТИКИ-НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИМ ДИСБАЛАНСОМ ЧЕЛОВЕКА. Вестник восстановительной медицины № 4•2017

А ткже полнотекстовые статьи по разным асмектам МСММ на сайте Института аналитической токсикологии https://www.iat.com.ru/  в разделе «Статьи».

Контакты:

143441, Московская область, Красногорский р-н, д. Гаврилково,

ЭЖК Эдем мкр., квартал III, дом № 2, этаж 1, помещение 1.

Телефон: +7 (495) 902 7276

E-mail: info@iat.com.ru

Web: www.iat.com.ru

 

Комментировать