Экспрессное детектирование микроорганизмов в объектах окружающей среды методом масс-спектрометрии микробных маркеров

Скачать оригинал 

Осипов Г.А., Веденин А.Н.

Международный аналитический центр ООО «Интерлаб», Москва

 

Цель. Показать возможности экспрессного детектирования и количественного анализа широкого круга микроорганизмов в почве, донных отложениях водоемов и других экологических объектах на фоне материала субстрата без предварительного культивирования пробы.

Материалы и методы.

Метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) применен для реконструкции микробного сообщества в разнообразных экологических нишах. Пробу грунта, ила, древних ископаемых материалов, соскобов с твердых поверхностей подвергали кислому метанолизу с последующим извлечением липидной фракции гексаном. Гексановый экстракт высушивали и силилировали. Полученные метил-триметилсилильные производные жирных кислот, спиртов и альдегидов анализировали методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии в режиме масс-фрагментографии. Специальный алгоритм применен для выявления микробных маркеров и реконструкции по ним микробного сообщества пробы.

Результаты и обсуждение.

Восемь образцов дерново-подзолистой почвы, отобранной в одном районе Московской области (ВНИИФ, Раменская горка), но отличающиеся фитоценозом, а также различной антропогенной нагрузкой. В значимом количестве во всех почвах представлены грибы, актиномицеты (роды Rhodococcus, Streptomyces, Pseudonocardia), бактерии: из грамположительных – аэробы и факультативные анаэробы Staphylococcussp. И Bacillussp., а также анаэробы Clostridiumpasterianum, C. perfringens, Acetobacteriumsp., Bifidobacteriumsp.); из грамотрицательных – аэробы Acetobacterdiazotroficus, Sphingobacteriumspiritovorum, Sphingomonascapsulata, Xantomonassp., различные виды псевдомонад, среди которых доминирует Pseudomonasfruorescens,  а также облигатные и факультативные анаэробы Bacteroidesruminicula, Wolinellasp.

Методом МСММ было исследовано таксономическое разнообразие бактериобентоса озер Самарской области (Шерышева и др., 2009). В оз. Серебрянка доминанты представлены видами Rhodococcus terrae, Butyrivibrio spp., Spirochaeta sp. В Нижнем ботаническом пруду преобладают Butyrivibrio spp., Clostridium spp, группа железоредукторов. В серных озерах Коржовcкое и Солодовка доминируют Nocardia carnea и представители родов Butyrivibrio, Clostridium, Beggiatoa, в оз. Голубое — виды Butyrivibrio spp. и Propionibacterium freudenreichii. В видовой структуре бактериобентоса в разных типах илов обнаружены специфичные виды. Так, в детритном иле оз. Серебрянка обитают простекобактерия р. Caulobacter, железобактерии Leptothrix sp. и пурпурная бактерия р. Rhodobacter. В серных илах озер Коржовское, Голубое, Солодовка и сероводородном иле пруда развиваются фототрофные бактерии рр. Thiорedia, Сhlоrоbium, Heliobacterium, бесцветные серобактерии рр. Thiothix, Macromonas, тионовые бактерии р. Thiobacillus. Обитатели цианобактериальных матов рр.Beggiatoa и Flexibacter обнаружены только в серных илах. Численность бактериобентоса в озерах изменяется от 7,5х107 до 2,8х109 кл/г сухого ила. В анаэробных серных илах максимально представлены анаэробы бродильщики (51-86%). В илах, обогащенных железом, возрастает доля хемолитотрофных железоредукторов (11-14%).

Исследованы образцы мерзлотных грунтов из Восточной Сибири возраста от 10 тысяч лет до 3 млн лет. В древнем образце доминируют виды Micrococcus, Arthrobacter, Acetobacter diazotrophicus, Rhodococcus terrae, Aeromonas hydrophila, WolInella, Nocardia asteroides в количестве 4х107-7х106 далее по ранжиру Clostridium putrificum, актиномицеты, Acinetobacter, Moraxella, Methylococcus, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus equi, Sphingomonas capsulata, Caulobacter, Cytophaga, Flavobacterium gillisiae, Micromonospora, Pseudomonas putida, Xanthomonas и другие микроорганизмы – всего 36 таксонов. Пробы ранние (10 тыс и 50 тыс лет) близки по составу древнему образцу, но отличаются доминантами и соотношением численности таксонов. В пробе из подледного анатарктического озера (возраст 170 тыс лет) обнаружены маркеры 25 таксонов микроорганизмов, но в отличие от арктических, здесь доминирут, вместе с Micrococcus и Arthrobacter, маркеры клостридий и актинобактерий – родококков, нокардий, псевдонокардий и не установленных родов и видов. В мерзлотном грунте из Канады (возраст не известен) доминируют Acetobacter diazotrophicus, Rhodococcus terrae, Aeromonas hydrophila, присутствуют Moraxella, Nocardia, Xanthomonas, Cytophaga – всего 30 таксонов общей численностью 4х107 клеток/г. Параллельно в посевах на питательные среды из Арктических образцов мерзлоты в числе доминантных бактерий получены виды Micrococcus, Rhodococcus, Arthrobacter, Cytophaga, Flavobacterium, Xanthomonas. Среди культивируемых форм в посевах из антарктических образцов мерзлоты доминируют виды Micrococcus, Rhodococcus, Bacillus. Кроме того получены культуры бактерий родов Cellulomonas, Planococcus, Psyhrobacter, Moraxella, Pseudomonas и сем. Enterobacteriaceae. Что подтверждает достоверность маркерного анализа.

При анализе музейных раритетов (бумага, кожа, каменные изваяния) с микробной деструкцией обнаружено, что наиболее уязвимы изделия из кожи. Их разрушает обширное микробное сообщество, где лидируют актинобактерии по большей части – не известные. Найдены родококки, стрептомицеты, нокардии. Обнаружены по маркерам бациллы, стафилококки, псевдомонады, сфингомонады, ацетобактер, нитробактер, бутиривибрио и другие. Всего кокки и бациллы – 6х108 клеток/г, грамотрицательные аэробы 3х108, актинобактерии 4х108, клостридии 5х107 и грамотрицательные анаэробы 7х106 клеток/г кожи.

Выводы.

Масс-спектрометрия микробных маркеров позволяет детектировать виды микроорганизмов в окружающей среде и мониторировать количественные изменения в составе микробного сообщества.

 

Комментировать