Верификация метода МСММ

В пользу микробного происхождения жирных кислот, альдегидов и стеринов, не характерных для клеток организма человека, свидетельствуют следующие соображения и факты.

Хорошо известно, что  в клетках млекопитающих  отсутствуют гидрокси, циклопропановые и ненасыщенные ЖК

В результате проведенных нами  анализов (несколько тысяч) биологических жидкостей человека и животных было определено, что динамичное изменение состава минорных ЖК свидетельствует об их экзогенном происхождении

Состав ЖК макроорганизма колеблется в пределах 25% от их среднего значения в разных пробах, а состав микробных маркеров от 0 до максимума в тяжелых случаях воспаления

При проведении этиотропной антибактериальной терапии значения минорных компонентов в крови возвращались к нормальным

Концентрация микробного маркера коррелирует с  активностью воспалительного процесса (3-гидрокси-пальмитиновая кислота в крови как маркер Brucella  в случае экспериментального бруцеллеза у морских свинок, 72 дневный курс)12

Концентрация микробных маркеров Salmonella в крови пациентов с сальмонеллезом кореллирует со значениями титров антител12

Концентрация 10-гидроксистеариновой кислоты (маркер  Сlostridiumperfringens) пациентов с синдромом длительного сдавливания и диагнозом “газовая гангрена” коррелирует с наличием и количеством С.perfringens, подтвержденным культуральным методом6

Наконец, клинические наблюдения показывают нормализацию микроэкологического статуса организма человека и подавление инфекции в результате лечебных мероприятий по данным масс-спектрометрии микробных маркеров.

В качестве примера, подтверждающего специфичность маркера приведем результаты поиска маркеров С.perfringens при газовой гангрене6 (табл. 3).

Таблица 3

Сопоставление клинических, бактериологических и ГХ-МС данных диагностики клостридиальной инфекции в сравнении с контрольными

Фамилия, № и.б. Клинический диагноз Бактериологич.

данные

Концентрация* 10-оксикислот Летучие

кислоты

        18:0 18:1  
1. Г-н, 5229 Анаэробная клостридиальнаяфлегмона C.perfringens 2,4 0,0 масляная
2. М-н, 5288 Газовая гангрена C.perfringens 5,4 0,2 пропионовая масляная капроновая
3. М-н, 5272 Газовая гангрена Клостридии 7,8 0,0 масляная валериановая капроновая
4. П-н, 5248 Анаэробная клостридиальная флегмона Клостридии 5,6 6,2 пропионовая изомасляная масляная
5. Т-н, 5261 Анаэробная флегмона Клостридии 22,1 2,0 масляная валериановая
6. Г-н, 5234 Костная посттравматическая рана Стафилококк 0 0 масляная энантовая
7. О-ва,5256 Анаэробная неклостридиальная флегмона Энтерококк, синегнойная палочка, протей  0 0 отсутствие
8. Здоровая ткань Послеоперационный материал ткани бедра Не инфицирована 0 0 отсутствие
9. Б. Пептококковая инфекция Пептококк 0 0 уксуснаяпропионоваямаслянаяизовалериановая

 

Экспериментальные данные показывают, что 10-оксикислоты С18 появляются лишь у тех пациентов, у которых бактериологический анализ обнаруживает присутствие клостридий, а клиническая картина соответствует газовой гангрене. В здоровых тканях, а также в тканях с неклостридиальной анаэробной инфекцией эти кислоты отсутсвуют.  Все изученные виды клостридий при инфицировании животных вырабатывают 10-оксидекановые кислоты, но вид C.perfringens в несколько раз более активен.

Проведено также тестирование метода масс — спектрометрии микробных маркеров по фекалиям, поскольку микробиота фекалий подробно изучена7,8,69,70. Лидирующим в количественном отношении, по нашим данным, оказался род Eubacterium. Далее по ранжиру следуют клостридии, бактероиды, лактобациллы и бифидобактерии. Их доля составляет 84-94% от суммы по данным МСММ. Аэробы представлены в основном кокками разных таксонов, аэробными актиномицетами (актинобактериями) и микроскопическими грибами. Энтеробактерии, псевдомонады, другие грамотрицательные аэробы и вирусы присутствуют в минорных концентрациях. Данные по микробному сообществу фекалий получены у практически здоровых людей разного пола и возраста. Оказалось, что количественный состав микроорганизмов и их сумма резко индивидуально различны. Вариации по сумме составляют порядок, а по отдельным микробам до двух порядков и более. Например, разница на порядок по бифидобактериям, на два порядка по лактобациллам, на три порядка по пропионовым бактериям, хеликобактеру и Clostridiumramosum. Результат еще раз свидетельствует о нестабильности состава фекалий и, следовательно, проблематичности его использования для оценки изменений микробиоты кишечника: колебания в норме перекрывают патологические сдвиги.  Сам факт существования этих микроорганизмов в составе фекалий известен, но из отдельных измерений в разных лабораториях, а также обобщений в руководствах.  Данные МСММ подтверждают известные, но сразу по всем микроорганизмам фекалий в одном анализе и с большой точностью по сравнению с культуральным и, пожалуй, генетическим (FISH) методами (табл. 5).

Таблица 5

Сопоставление данных анализа микробиоты фекалий генетическим, культурально-биохимическим и масс-спектрометрическим методами.

 

  Состав микробиоты фекалий взрослых людей,

клеток/г мокрого веса

  Масс-спектрометрия Генетический метод, Harmsen, 2002 Культуральный метод
Бондаренко, 2003 Маянский (Schaechter) Фирма Hoechst
Общая численность 0,6-5´ 1011 3,5 ´ 1010 1010-1011 1010-1012 2 × 1011
Доля анаэробов, % 84-94 До 100 90-95 До 100 33-100
Eubacterium 1011 7,1 ×109 109 – 1010 109 – 1012 3 × 1010
Бактероиды 1010 9,5 ×109 109 — 1010 1010 — 1012 1011
Клостридии 6 × 1010 7,9 ×109 105 — 108 105 — 1011 3 × 1010
Бифидобактерии 1010 1.7 ×109 109 — 1010 108 — 1012 2 × 108

Полученная методом ГХ-МС общая численность микроорганизмов фекалий находится в пределах интервала значений 0,6-5´ 1011кл/г, что согласуется с известными литературными данными измерений генетическим и культурально-биохимическим методами. Совпадает с известными оценками и относительное количество анаэробов в них, которое по этим данным составляет 88%. Родовое распределение трудно сравнивать с литературными данными, так как в них приводится очень широкий диапазон значений,в пределах трех-шести порядков. Тем не менее, совпадает оценка о приоритете рода Eubacterium, численность которых имеет порядок  1011кл/г (109 – 1012 по литературным данным),  о количестве бактероидов 1010кл/г (1010 — 1012 по известным данным), клостридий — 6 х 1010кл/г (105 — 1011 соответственно), бифидобактерий 1010кл/г (1010 — 1012), а также по энтерококкам, энтеробактериям, лактобациллам  и стафилококкам. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными результаты измерений  численности микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки и других клинических пробах.

Результаты разных исследований микробиоты фекалий отводят бифидобактериям в их составе почти от 100% до 0,1%.  Диапазон в три порядка вряд ли вызван межлабораторной воспроизводимостью — в каждом исследовании приводится серьезная статистика и добросовестная аналитическая процедура. Разницу следует, скорее, отнести к  особенностям самого материала и точностью сопоставляемых методов количественных измерений. Не вдаваясь в детали, можно заключить, что эффект доминирования бифидобактерий создает рутинная практика анализа только бифидобактерий, иногда лактобацилл, еще реже — клостридий и бактероидов в сопоставлении с долей условно-патогенной микрофлоры при исследованиях дисбактериозов. Как видно из поля зрения микробиолога при этом выпадают эубактерии, бактероиды и клостридии, которых в фекалиях по современным оценкам по крайней мере в несколько раз больше, чем бифидобактерий. Это заблуждение выглядит естественным, если вспомнить, что в рамках общей микробиологии принято считать, что в микробном сообществе в среднем культивируемыми являются не более 20% микроорганизмов любого местообитания. Что касается фекалий, то по оценкам молекулярно-генетическими методами так же оказывается, что определение 60-80% их микробиоценоза не доступно для культуральных методов исследования. Данные масс-спектрометрии коррелируют с генетическими  (в рамках сопоставимости микробиологических количественных измерений) и одинаково показывают, что эубактерий, бактероидов и клостридий вместе и по отдельности на порядок больше, чем бифидобактерий.

С Институтом физико-химической медицины проведено сопоставление данных состава микроорганизмов фекалий людей, определенного метагеномным методом и методом МСММ рис.  Как видно из рисунка, получено хорошее с позиции батериологического исследование совпадение результатов. Оба анализа показывают доминирование в материале клостридий и эубактерий. Бактероиды, бифидобактерии и пептострептококки занимают следующий уровень по численности. Но на порядок отличаются результаты по превотеллам, руминококкам, энтеробактериям: по данным МСММ их больше в фекалиях.

Рис. Сопоставление состава микроорганизмов фекалий людей методами метагеномного анализа и МСММ. Состав в процентах от суммы.

Хорошее совпадение результатов бактериологического анализа дает параллельный анализ 96 проб культуры крови, проведенный в НЦ ССХ им А.Н.Бакулева методами посева на питательные среды и масс-спектрометрическим.  Анализ и обобщение полученных результатов показали совпадение данных метода ГХ-МС с данными бактериологического метода. При идентификации гемокультур методом ГХ-МС результаты получены в среднем через 3 ч после начала анализа, тогда как при  проведении традиционного микробиологического исследования — через 1,5-2 сут. (Попов, 2013). Часть анализов показана в таблице.

Автор: Осипов Г.А.

 

Комментировать